MSTN打靶猪的安全性分析

李诚瑜，刘昭君，申 明，李荣阳，陶景丽，吴望军，刘红林

（南京农业大学动物科技学院，江苏 南京 210095）

1 MSTN基因简介

Myostatin（MSTN）基因，中文名为肌肉生长抑制素基因，是转化生长因子β（Transforming Growth Factor-β，TGF-β）超家族成员之一，是一种抑制肌肉生长发育的负调控因子[1]。在胚胎发育阶段，MSTN在生肌节细胞和发育的骨骼肌中表达，对肌纤维的数量起着非常重要的调控作用。在成年动物体内，MSTN在骨骼肌中特异表达，能有效控制肌纤维的生长[2,3]。而大量的研究发现，MSTN基因敲除和自然纯合突变的小鼠、牛、狗和人类均表现出骨骼肌肥大的现象[4-7]。因此，MSTN是一个在多物种中影响肌肉生长发育的重要功能基因。

2 动物遗传修饰的概念与理解

动物遗传修饰（Genetic Modification）是指人为改变动物的基因组（遗传物质），主要包括转基因与基因敲除。转基因动物（Transgenic Animal）是指利用实验方法将外源基因导入动物染色体基因组内，外源基因能在动物体内表达并稳定遗传给后代的一类动物[8]。转基因动物的起源要追溯到1982年由Palmiter实验室做出的世界首例转基因小鼠[9]。自此，转基因动物技术已在多个物种之中得到应用，包括猪、牛、羊、兔、鼠、鱼等[10-12]。基因敲除是指采用基因组编辑技术去除基因组某个固有基因的部分序列，从而导致该基因功能下降或缺失[13]。

3 动物基因编辑技术

基因编辑技术（Genome Engineering Technologies）是指对基因进行定点敲除或插入从而实现对基因功能的改造的一种技术，又称基因打靶技术，目前已经被广泛应用于各种动物基因组的修饰中[14]。目前主要的基因编辑技术包括：巨核酶技术（Meganucleases）、锌指核酸内切酶（Zinc Finger Endon-uclease，ZFN）、类转录激活因子效应物核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nuclease，TALEN）、Cre/loxP系统、CRISPR-Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palind-romic Repeats-CRISPR-Cas9-associated proteins）技术、SGN技术，以及目前备受争议NgAgo技术，其中研究最热的属基因组编辑技术当属CRISPR-Cas9系统[15,16]。CRISPR-Cas系统主要分为3种类型，其中Ⅱ型CRISPR-Cas系统最为简单，其利用gRNA结合到目的基因片段引导Cas9蛋白将DNA双链切断，实现基因的定点修饰。CRISPR-Cas9系统相对其他基因编辑技术有设计操纵更加简便、编辑更加高效、通用性更广等优势，已经成为新一代基因组编辑技术，将为基因组定向改造调控与应用等带来突破性革命，为产生新的、基因编辑更加高效的转基因动物带来新的契机[17]。

4 MSTN基因编辑猪的安全性分析

随着基因编辑技术的飞速发展，世界各地相继报道了多种转基因动物。运用基因编辑技术科学家们可以定点、定时地对动物基因组进行基因的敲除与插入。为了获得肌肉量更多的动物，利用基因编辑技术敲除或改造肌肉生长抑制因子MSTN基因，使之失去对肌肉生长发育抑制的功能，从而生产出产肉率高的MSTN基因编辑动物不失为一种高效的生产手段。那么通过基因编辑技术所获得的MSTN打靶猪产肉量是否能提高，其所生产的猪肉是否与普通猪一样安全？

近年来，转基因动物的安全性受到社会各界的广泛关注，其安全性和食品安全问题也是社会各界讨论的热点话题。转基因技术给人类创造巨大利益的同时，也带来巨大挑战，有人认为转基因动物可能对人类和生物环境产生重要影响，例如过敏性反应、抗药性问题、基因污染等问题。目前关于转基因动物安全性评价尚无统一标准，按照我国最新修订的文件来看，转基因动物安全性评价包括以下几个内容：分子特征、遗传稳定性、健康状况、功能效率评价、环境适应性、转基因动物逃逸及其对环境的影响和食用安全[18]。

动物转基因技术相较于克隆技术，其产品的食用安全性也存在着较大争议，世界粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）为此成立了专门的专家组讨论转基因动物产品的食用安全性评价策略。目前最为普遍认可的是“实质等同性原则”[19]，即指出如果某个新食品或食品成分与现有的食品或食品成分大体相同，那么它们是同等安全的。“实质等同性原则”包括3方面内容：被转入基因的分子特征分析、转基因动物组织的形态分析、所构成食物的成分分析。

针对利用基因编辑技术生产的高产肉性能的猪肉是否能安全食用这一热点问题，大量的MSTN相关文献的结论偏向于MSTN基因编辑猪是安全的。

4.1 MSTN基因编辑猪无外源基因的整合

MSTN基因编辑猪只是利用基因编辑技术将其中一条染色体上的等位基因片段敲除了一部分，目的是使MSTN抑制肌肉生长发育的功能失活或减弱，并没有外源基因整合到猪的基因组当中去；另外，为了降低MSTN基因编辑猪表型异常的概率，对目标基因只是进行了单等位基因的编辑，也即只是减弱了MSTN抑制肌肉生长发育的效应，而并没有完全使之失活，这样生产出来的MSTN基因编辑猪与普通猪相比，其他表型没有太大差异。

4.2 无抗性标记

传统的转基因动物在生产前期工作中，为了获得阳性转基因细胞系，在细胞筛选过程中大多带有抗性标记，抗性标记的存在可能会导致潜在的食用安全风险。而MSTN基因基因编辑猪完全是不带有抗性基因，因此，不存在由抗性标记基因带来的潜在风险。

4.3 自然界早已存在MSTN基因突变的家畜动物

近200年前就有人发现有些牛的肌肉异常发达，而在1997年时，美国科学家ALEXANDRAC.MCPHERRON发现比利时蓝牛和皮埃蒙特牛都存在MSTN的自然突变，比利时蓝牛MSTN基因第3外显子上发生了11bp的缺失突变，该缺失导致MSTN蛋白的移码突变，MSTN抑制肌肉生长发育的功能受到抑制[20]，这种突变的比利时蓝牛全身肌肉异常发达，具有特别明显的双肌臀表型（如图1与图2所示）。而皮埃蒙特牛MSTN基因第3外显子上发生G/A错义突变，使酪氨酸转变为半胱氨酸，其突变同样也会引起皮埃蒙特牛双肌臀表型[21]。

另外，在羊上的研究同样发现，在特塞尔绵羊（Texel sheep）MSTN基因g+6223G/A突变导致了miR-1与miR-206的结合位点缺失[22]，从而使MSTN蛋白翻译受阻，最终导致了特塞尔绵羊肌肉的肥大（如图3所示）。

如今，科学家在不同物种双肌臀个体MSTN基因中发现了多种不同的突变，包括移码、终止和缺失突变等，几乎包含了所有突变类型。无论哪种突变，其结果都是改变MSTN基因抑制肌肉生长的效应，导致双肌臀表型的出现。由此可见，MSTN基因在自然界本身就存在许多天然突变，至今尚未见因食用这些突变物种的肉导致不适的报道。

综上所述，通过基因编辑技术生产的MSTN打靶猪是安全的，它将为我们培育产肉量多的新品系猪提供新的契机与渠道。