外源磷输入对底泥砷污染香蒲根系分泌烃类物质的影响

杜崇宣 刘云根,2 王 妍 包宁颖 陈 天

（1.西南林业大学生态与环境学院，云南 昆明 650233；2.西南林业大学生态与环境学院云南省山地农村生态环境演变与污染防治重点实验室，云南 昆明 650233）

砷（As）是一种具有强毒性的环境污染物[1]，广泛应用于冶金、含As杀虫剂、除草剂、木材防腐剂和饲料添加剂等，过量的As释放到环境中，导致土壤和水体的As污染问题日益严重[2-3]。目前，土壤重金属的修复方法主要有物理化学修复和生物修复，但是物理化学修复存在着易产生二次污染和工艺复杂等问题，而生物修复显得更加的绿色环保，在重金属的污染治理中得到广泛应用。磷（P）和As同属第Ⅴ族元素，自然界中往往共生，形成相似的P酸盐（PO43-）和As酸盐（AsO43-），两者在土壤中存在竞争吸附关系[4]，在植物中主要表现为拮抗和协同效应[5]。植物对重金属的污染修复作用主要源于根系，而根系分泌物在这个过程中发挥着至关重要的作用。同时，根系分泌物组分易受营养盐水平或重金属元素等因素影响，导致其功能和含量发生变化。因此，研究外源P输入对As污染生境中植物根系分泌物的影响具有一定的科学意义。

植物在生长过程中由根系不同部位分泌产生的无机离子或小分子有机物统称为根系分泌物。烃类是一种简单的碳氢化合物，碳链结构稳定，较难降解，在自然界中广泛存在，是植物根际微生物的重要碳源，已有研究表明，烃类物质在植物根系分泌物中所占比重较大[6]。目前，有关烃类物质的研究主要集中在原油污染土壤[7-9]、海洋溢油事故[10-11]、芳香烃类物质对人及动物的毒性等方面[12-13]，而有关植物根系分泌物烃类物质的研究相对较少。

香蒲（Typha angustifolia）是一种多年生或沼生草本植物[14]，广泛分布于我国，其根系发达且生长迅速，在湿地生态系统中的作用一直受到关注[15-17]，香蒲对环境胁迫耐性较强，是国内外公认的湿地水生植物优势品种[18-19]。目前关于香蒲的研究涉及香蒲根内生细菌群落多样性[20-21]，香蒲对重金属的吸收[22-23]及吸收途径，等方面，而关于环境因子对香蒲根系分泌物的影响报道较少。因此，本研究拟通过土壤培育试验探索不同外源P输入对As污染底泥香蒲根系分泌烃类物质的影响，揭示湿地植物根系分泌物应对As和P交互作用所作出的应对措施，为重金属污染地区植物修复技术提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试香蒲购自云南省昆明市富民县香蒲种植基地(东经102°34′42″,北纬 25°12′49″)。土壤采自校园内无As污染红土，采用多点混合法，风干后备用。试验于2018年4月6日在温室内进行。模拟试验所用土壤基本性质由表1所示。

表1 供试土壤的基本性质Table 1 Fundamental properties of the tested soil

1.2 试验方法

1.2.1 土壤培养试验

取回的土壤自然晾干、粉碎，过2 mm筛后备用。使用前将土壤与有机复合肥按体积比1∶2混合，使用黑色聚乙烯塑胶桶（直径 25 cm,高 35 cm）作为湿地模拟装置（共计15个），每桶装入15 kg干土和10 L无菌水致淹水状态并标记出每个湿地装置的持水线高度。以Na2HAsO4·7H2O为As源，向模拟湿地装置土壤中添加50 mg/kg As，搅匀，并将土壤至于常温、黑暗环境中老化1.5个月。待土壤老化以后，每个湿地装置移栽4株生长一致，苗龄为1个月的香蒲幼苗，以盆为重复，每个处理3个重复，共15个重复。设置空白对照CK1（底泥无As源添加，无外源P输入），待植物正常生长1周后向湿地装置中以溶液的形式分别添加CK2（0 mg/L）、低（0.2 mg/L）、中（2 mg/L）、高（20 mg/L）4个梯度的外源P污染，选用KH2PO4作为P源，定株培养60 d，培养时间为2018年4月13日—2018年6月13日，期间每隔1个星期向各湿地装置中添加无菌水至持水线高度。

1.2.2 香蒲根系分泌物的收集

参考韦雪晶等[6]的方法并加以改进，将4株生长一致的植物从土壤中小心取出，并用去离子水冲洗根系4次，洗净根部的土壤颗粒后用20%质量分数的H2O2溶液浸泡10 min，用去离子水洗净根系后，将根系转至盛有300 mL 0.5 mmol/L CaCL2溶液中，并保证根部处于避光条件下收集根系分泌物12 h。收集完成后，将收集好的浸提液定容至300 mL，过0.45 μm微孔滤膜。取浸提液加入分液漏斗与二氯甲烷按1∶1的体积比萃取3次，合并萃取液，取有机相到旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司，中国）浓缩蒸发，减压浓缩至干后用2 mL色谱纯二氯甲烷润洗溶解有机相并过0.45 μm有机滤膜后装入2 mL样品瓶-20 ℃保存备用。

1.2.3 根系分泌物GC-MS分析

提取后的根系分泌物采用GC-MS（俊齐仪器设备有限公司，美国）测定。采用电子轰击源，轰击电压70 eV，质量范围从 30～600 m/z 扫描，扫描速度0.2 s扫全程，离子源温度230 ℃。毛细管柱：HP-5 MS柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），进样口温度250 ℃，柱温50 ℃（保持 2 min），以6 ℃/min程序升温至250 ℃（保持15 min）。载气为氦气，流量l mL/min，进样量为l次。为消除实验误差，按照相同测定条件以萃取剂二氯甲烷作空白试验。应用NiST08质谱数据库，分析质谱图，选取匹配度在90%以上的物质检出并做进一步分析，确定各组分物质名称。采用外标法进行定量分析，用各化合物标样的5、10、20、40、80 mg/L为工作曲线，将系列检测到各化合物峰面积带入标准曲线计算浓度，各标准曲线线性相关系数（R2）为0.920 2～0.999 4，线性相关系数均在可接受的范围内。

1.2.4 植物生长状况及根系As的检测

将洗净的香蒲根系用吸水纸擦干根系表面的水分以后，用电子天平（精确到0.000 1 g）称量鲜质量，用卷尺（精确到1 mm）测量根长，根系As的检测采用三酸消解法[24]检测。按公式（1）[25]计算根系耐性指数（TI）。

式中：Li为各处理组根的平均长度、Lc为对照组根系平均长度。

1.3 数据分析

采用SPSS 18.0和Microsoft Excel 2010软件对实验数据进行单因素方差和数据均值及标准差分析，采用Canoco 4.5对实验数据进行RDA和PCA分析。

2 结果与分析

2.1 外源P输入对底泥As污染香蒲生长及根系As含量的影响

由表2可知，不同外源P输入对底泥As污染香蒲生物量的影响呈现出先增加，后减少的趋势。与CK1相比，底泥As污染处理后，植物生物量显著性增加（P＜0.05），且外源P以低浓度输入，植物生物量达到峰值后便逐渐降低，中浓度外源P输入植物生物量没有显著性变化，高浓度外源P输入则显著抑制植物生长（P＜0.05）；底泥As污染，不同外源P输入下，香蒲均能正常生长，并且长势良好，可知香蒲对环境因子的改变有较强的适应能力。

表2 外源P输入下底泥As污染香蒲的生物量Table 2 Biomass of T.angustifolia in As contaminated sediment condition under exogenous P input g/盆

由表3可知，底泥As污染处理后，随着外源P的添加，香蒲根系As浓度先降低后增加，即低浓度外源P输入，植物根系As浓度下降，但不显著，中高浓度外源P输入，植物根系As浓度显著上升（P＜0.05）。植物根部是作为最先接触土壤重金属的器官，可以利用根长作为表征植物重金属舒耐性的指标[26]，由TI可知，在受到底泥As污染处理后，TI显著增加（P＜0.05），说明底泥As污染处理并没有抑制香蒲生长，反而起到一定的促进作用。与CK2相比，不同外源P处理后，低浓度外源P输入TI有所增加，但不显著，中、高浓度P处理TI开始降低，这表明低浓度外源P输入促进植物生长，而中、高浓度外源P输入开始抑制植物生长。

表3 外源P输入下底泥As污染香蒲根系As浓度及TITable 3 Concentration and tolerance index of T.angustifolia roots in As contaminated sediment condition under exogenous P input

2.2 外源P输入对底泥As污染香蒲根系分泌烃类物质种类的影响

由图1a所示，香蒲根系分泌的烃类物质中烷烃类物质的种类均多于烯烃类物质。由图1b可知，当外源P以不同浓度输入时，根系分泌的特有烷烃类物质便明显高于特有烯烃类物质；香蒲根系分泌的烃类物质种类均表现为处理生境高于常规生境，当外源P以低浓度输入达到峰值后便逐渐降低；对烷烃类物质而言，CK2与CK1相比，物质种类明显增加，与CK1相比，外源P以不同浓度输入时，物质种类均明显增加，与CK2相比，外源P以不同浓度输入时，除外源P以低浓度输入时，物质种类明显增加外，其余均无明显变化；烯烃类物质的变化趋势略不同于烷烃类与烃类物质，CK2与CK1相比，物质种类明显增加；与CK1相比，外源P以不同浓度输入时，物质种类均明显增加，与CK2相比，外源P以不同浓度输入时，均无明显变化；底泥As处理且外源P以不同浓度输入时，烷烃类和烯烃类物质物质种类无明显变化。可见香蒲根系分泌的烃类物质中，烷烃类物质的种类多于烯烃类物质的种类；外源P输入和As污染生境会促进香蒲根系烃类物质种类的分泌；底泥As处理且外源P以不同浓度输入时，根系分泌的烃类物质呈现出先增加后降低的趋势。

图1 外源P输入对底泥As污染香蒲根系分泌烃类物质及特有烃类物质种类的影响Fig.1 Effects of exogenous P inputs on the secretion types of hydrocarbons and special hydrocarbons from the roots of T.angustifolia under As contaminated sediment condition

2.3 外源P输入对底泥As污染香蒲根系分泌烃类物质含量的影响

由表4可知，香蒲根系分泌共有烃类化合物中，从种类上来看，烷烃类化合物表现出了极大的优势地位，从化合物结构特征上来看，链状结构占优势地位，在检测到的20种共有烃类化合物中，共17种烷烃类化合物，其余3种为烯烃类；香蒲根系分泌的17种共有烷烃类化合物中，有14种化合物呈链状结构，仅3种化合物呈环状结构；14种链状烷烃化合物中有11种正构烷烃，仅有3种支链烷烃，而检测到的烯烃都是支链烯烃。可见，香蒲根系分泌的共有烃类物质以简单的链状正构烷烃类化合物为主。底泥As污染生境中，不同浓度外源P处理显著促进香蒲根系烃类物质分泌（P＜0.05）。与CK1相比，CK2（P＜0.05）除环状烷烃没有显著性变化外，其余化合物浓度均显著增加（P＜0.05），不同外源浓度外源P处理后，所有烃类化合物浓度显著增加（P＜0.05），且显著高于CK2（P＜0.05）。可见As、P双因子交互处理比底泥As单因子处理更能促进香蒲根系烃类物质分泌。

底泥As处理且外源P以不同浓度输入显著促进香蒲根系烃类物质的分泌。与CK1相比，绝大多数烃类化合物浓度均显著升高（P＜0.05）。由图2a可知，烯烃类物质在外源P以低、中、高浓度输入平均增长百分比均高于烷烃类物质；烷烃类物质不同结构化合物在底泥As处理且外源P以低、中、高浓度输入平均增长百分比均表现为正构烷烃＞环状烷烃＞支链烷烃。与CK2相比，大部分烃类物质浓度均显著升高（P＜0.05）。烯烃类物质在底泥As处理且外源P以低、中、高浓度输入平均增长百分比均低于烷烃类物质；烷烃类物质不同结构化合物在底泥As处理且外源P以低、中浓度输入平均增长百分比均表现为正构烷烃＞环状烷烃＞支链烷烃，当底泥As处理且外源P以高浓度输入平均增长百分比均表现为支链烷烃＞环状烷烃＞正构烷烃。可见As和P交互处理比底泥As单因子处理更易促进香蒲根系烃类物质的分泌；底泥As处理易促进烯烃类物质的分泌，而As和P交互处理则促进烷烃类物质分泌；不同结构烷烃类化合物的平均增长速度为正构烷烃＞环状烷烃＞支链烃。

表4 外源P输入下底泥As污染香蒲根系分泌烃类物质共有成分浓度Table 4 Common component concentration in hydrocarbons secreted by roots of T.angustifolia in As contaminated sediment condition under exogenous P input mg/L

图2 不同种类和结构烃类物质与CK1及CK2相比平均增长百分比Fig.2 Average percentage increase in hydrocarbons of different types and structures compared to CK1 and CK2

由表5～6可知，当香蒲受到逆境胁迫时，香蒲根系分泌的特有烃类物质以支链烃类为主。由表5可知香蒲根系分泌物中共检测出19种特有烷烃类化合物，在香蒲根系分泌的19种特有烷烃类化合物中，有15种是支链的链烷烃，有3种为正构烷烃，只有1种呈环状结构；由表6可知香蒲根系分泌物中共检测出11种烯烃类化合物，在香蒲根系分泌的11种特有烯类化合物中，有10种均呈链状结构，仅有1种环状结构存在，在10种链状结构中，9种均为支链烯烃。

表5 外源P输入下底泥As污染香蒲根系分泌烷烃类物质特有成分浓度Table 5 Concentration of special components in secretion of alkanes from T.angustifolia roots in As contaminated sediment condition under different exogenous P input mg/L

表6 外源P输入下底泥As污染香蒲根系分泌烯烃类物质特有成分浓度Table 6 Concentration of special components in secretion of olefins from T.angustifolia roots in As contaminated sediment condition under different exogenous P input mg/L

2.4 底泥As处理香蒲根系分泌烃类物质与环境因子PCA和RDA分析

采用主成分分析法（PCA），将不同外源P处理作为环境因子，将香蒲根系分泌的烃类共有组分作为研究对象绘制线性排序图对不同外源P输入香蒲根系分泌的共有烃类化合物进行分析。由图3a可知，高浓度外源P环境因子附近的箭头集中较多，其次为低浓度，次之为中浓度，最后为CK2，因此，底泥As污染生境中，不同外源P输入对香蒲根系分泌烃类物质浓度的影响为高浓度＞低浓度＞中浓度＞CK2。采用冗余分析法（RDA），对根系分泌烃类物质浓度、种类与植物根系As富集浓度和根系耐受指数分析可知，绝大多数箭头穿过图3b红色圆圈，只有5,5-二乙基十七烷一种化合物穿过蓝色圆圈，十四烷不在圈内，这说明绝大部份烃类物质浓度及种类与植物根部As富集浓度呈显著正相关关系（P＜0.05），同样，由图3c可知，绝大部份烃类物质浓度及种类与TI呈显著正相关关系（P＜0.05）。

图3 底泥As处理香蒲根系分泌物与外源P输入PCA 和RDA 分析Fig.3 Analysis of PCA and RDA between root exudates and exogenous P input in As contaminated sediment condition

3 结论与讨论

根系分泌物是根系对土壤环境生化适应的产物，植物在生长过程中，根系从环境中摄取养分的同时，也向环境中分泌质子和离子，并释放大量有机物，根系分泌物的影响因素是多方面的，任何影响植物生长和生理的因素均会影响根分泌物的数量和种类[27-28]。本研究的结果也进一步印证了这一观点，As和P这2个环境因子均会对植物生长和生理产生影响，从而导致根系分泌烃类物质的数量和含量发生了改变，由图3c也可知，根系分泌烃类物质浓度和种类与TI，即植物根系生长状况呈显著性正相关关系。As是植物生长不需要的有毒痕量元素[29]，但是，也有相关研究表明低浓度的As可以促进植物的生长[30]，由表2和表3可以看出本研究也得出了相同的结论。这可能是因为底泥50 mg/kg As处理时，底泥中存在着大量的AsO43-，而PO43-和AsO43-结构相似，它们在土壤中共同竞争吸附点位，游离的AsO43-将底泥中原来被土壤胶体吸附的生物有效性较低的PO43-置换出来提高了土壤中P的有效性，促进了香蒲对P的吸收，刺激了香蒲的生长发育，从而显著增加香蒲根系烃类物质种类与含量的分泌。P和As为同族元素，As酸盐和P酸盐具有相似的理化性质，二者不仅在土壤颗粒表面和根系的自由空间竞争吸附位点，而且竞争细胞膜上共同的吸收转运系统[31-33]，由表3可推测当外源P以低浓度输入时，As与P在植物中主要表现为拮抗作用，因此在一定程度上会减少As的吸收，而外源P以中高浓度输入时，土壤溶液的P酸盐会竞争土壤颗粒表面As酸盐的吸附位点，提高As的生物有效性，最终增加了植物对As的吸收，从而抑制香蒲生长。因此香蒲根系分泌的烃类物质种类呈现出先增加后降低的趋势。

相关研究表明，微生物降解有机物的顺序为正构烷烃＞异构烷烃＞开环类的异戊二烯烷烃＞环状萜类化合物＞甾族化合物[34]，由图2可知，环境因子对不同结构烷烃类物质的影响（平均增幅）为正构烷烃＞环状烷烃＞支链烷烃，这可能与微生物的降解有关。由表2可知，P是植物生长发育所必需的营养元素，一定浓度的P可以促进植物的生长，而随着P浓度的升高，超过了一定浓度，就会抑制植物的生长发育。许多研究发现，植物在受到一定有害物质毒害时，根系分泌物组成成分的浓度会发生变化，增加根系分泌物中部分组分的产生和累积[35]，本研究可知，与常规生境相比，逆境胁迫促进烃类物质种类和浓度的增加，且同种物质不同结构，或是不同物质的增幅是不一致的，这可能是植物对有害物质毒害的一种应激反应，植物根系通过增加或减少根系分泌物的种类或是含量，又或者是某一类化合物浓度来调节根际微域环境，使得根际微域环境利于有害物质的分解。由图3b冗余分析结果也可以验证这个结论，香蒲根系分泌烃类物质的浓度和种类与根系As富集浓度呈显著正相关关系。至于逆境胁迫下，香蒲根系分泌的烃类物质为什么以支链烷烃为主及烯烃类物质的来源与作用研究较少，有待进一步研究。

根系分泌物是植物根系的次生代谢产物，对比环境因子胁迫前后根系次生代谢物质组成发现，胁迫环境香蒲根系次生代谢物质种类发生了很大变化。由图1a可知与CK1相比较，底泥As处理，不同外源P输入分别新检测出7、11、8、7种化合物，并且由表4～6中可知，香蒲在正常生境下的根系分泌烃类物质中以正构烷烃化合物为主，而当植物受到环境因子的胁迫时，香蒲根系便会开始大量分泌支链烷烃和支链烯烃化合物，从中可以推测，环境因子胁迫能够诱导香蒲根系次生代谢途径发生改变，导致根系次生代谢物质成分发生改变，以抵御环境因子的胁迫。其中，变化最显著的就是支链烷烃和支链烯烃化合物，处理前香蒲根系分泌物中检测到的支链烷烃和支链烯烃化合物较少，主要以正构烷烃化合物为主，处理后，香蒲根系分泌物中新检测到了大量支链烃和支链烯烃化合物。

根分泌物的释放与细胞膜的选择透性有关[36]，当膜完整性和选择性受损时，膜的透性就会增加，有机物从活体中大量释放，并引起不正常的泄漏[37]。由图3a可知，高浓度外源P输入对香蒲根系分泌烃类物质浓度的影响最大，相关研究表明[38]，污染物对植物的毒害与自由基有关，植物在逆境胁迫下细胞内自由基的代谢平衡被破坏从而导致自由基的产生，过剩自由基的毒害之一是引发或加强膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的伤害，严重时可导致植物细胞死，可见当外源P以高浓度输入时，植物体内会产生大量自由基，影响了细胞膜的通透性，因此高浓度外源P输入对香蒲根系分泌烃类物质浓度的影响最大。