木瓜蛋白酶酶解制备豌豆蛋白自由基清除肽(1)

张树成 杨进洁

摘要：本研究以豌豆蛋白为原料，选用木瓜蛋白酶对其进行酶解，利用响应曲面设计优化选取最佳的酶解条件。豌豆蛋白木瓜蛋白酶酶解最佳条件：加酶量12.1%（E/S）、温度60.2℃、pH 6.46、底物浓度7.15%（g/ml）。此条件下，最佳.O2.- 清除率为64.0%。经验证，所建模型预测准确可靠，酶解产物自由基清除率高，为相关生产和工艺产品开发提供参考价值。酶解液经透析分离，自由基清除率能力最強的酶解肽分子量小于1 KDa，说明酶解后得到的肽大多是2～8肽，.O2.-清除率为65.3±0.22%。经显著性分析发现透析能够显著提高抗氧化肽的纯化率，提高抗氧化肽对自由基的清除能力。

关键词：豌豆蛋白;木瓜蛋白酶;酶解;自由基清除率

豌豆（Pea）是我国的主要农作物之一。豌豆富含淀粉、蛋白质、纤维素及多种微量元素。具有调和脾胃、抗菌消炎、防癌治癌、促进肠道蠕动等功效。豌豆的种植面积广，价格低廉，在我国拥有相当丰富的资源，存在着极大的开发潜能。近年，酶解豌豆蛋白生成活性肽，比如抗氧化、降血压等，逐步成为研究热点。本实验室研究发现豌豆蛋白木瓜蛋白酶酶解产物DPPH清除率达98.2%，是一个很好的抗氧化肽资源。

我国对于豌豆的利用以淀粉为主，其对蛋白质的利用率较低。但在现阶段，豌豆蛋白的综合利用成为了国际上的一个研究热点。与其他豆科植物相比，豌豆富含赖氨酸，世界卫生组织推荐值的1.5倍。但其蛋氨酸和胱氨酸的含量较低，仅为推荐值的四分之一和五分之一。

除此以外，国际上现研究，豌豆蛋白通过酶解所获得的豌豆蛋白肽具有一些活性功能。比如，Ndiaye等人研究发现豌豆酶解液具有抗氧化、降低炎症和免疫调节的作用。而Huan Li等人的研究则表明，豌豆蛋白酶解后的产物为阳离子多肽，该多肽可以有效调节Ca MK II的活性，因而可以作为保健品被利用于心血管疾病的预防方面。Samson等人则发现豌豆蛋白可以抑制ACE酶的活性，从而起到降血压的作用。

酶法酶解生产抗氧化活性肽大多采用蛋白质酶解的方式。在酶解过程中，主要运用动物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶。本文采用了木瓜蛋白酶对豌豆蛋白进行酶解。

本研究旨在以自由基清除能力作为抗氧化活性的评价指标，通过响应曲面实验设计建立豌豆蛋白酶解条件预测酶解产物自由基清除率模型，以及最佳酶解条件和酶解产物，从而为豌豆蛋白的开发利用和加工拓宽思路、提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

木瓜蛋白酶购自济宁元素高科生物科技有限公司，木瓜蛋白酶的酶活力为50234 u/g。甲醛溶液等所用试剂均为分析纯。豌豆蛋白购自烟台双塔食品股份有限公司，主要组成为水分4.62±0.02%，蛋白质73.2±0.23%，粗脂肪0.22±0.01%，灰分4.62±0.03%。

1.2 试验仪器

单螺杆挤压机由山东理工大学农业工程与食品科学学院研制。

1.3 豌豆蛋白的酶解

称取一定质量的豌豆蛋白，加入一定质量的蛋白酶和一定pH值的磷酸盐缓冲溶液，摇匀，置于恒温振荡水浴锅中，酶解3 h，沸水浴灭酶10 min。冷却后，将蛋白酶解液过滤，滤液，记为酶解物。

1.4 自由基清除活性响应曲面实验设计

响应面法是利用多元二次回归方程，来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过回归方程寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。

1.5 酶解产物自由基O2.- 清除率活性研究

根据玄红专等人的方法 ，加以调整。实验组取0.3 mL的滤液加入试管中，准确移取5 mL Tris-HCl缓冲溶液（pH为8.2），于37℃恒温水

空白组将滤液更换为蒸馏水，实验步骤与上述相同。参比为5.3 mL的蒸馏水和0.3 mL的邻苯三酚溶液。计算公式如下：

清除率=（ΔA0-ΔA）/ΔA0×100%

其中，ΔA0为空白组吸光度每分钟的增值;ΔA为实验组吸光度每分钟的增值。

1.6 透析袋分离豌豆蛋白抗氧化肽

采用7、3.5、1 KDa的透析袋，对酶解液进行依次分离。预处理好的透析袋中加入约三分之二的酶解液，两端封好，放在蒸馏水中进行搅拌，每隔一段时间换一次水，直至透出液不再有颜色变化，将透出液用旋转蒸发仪浓缩，对浓缩液进行冷冻干燥，得到豌豆蛋白抗氧化肽粉。

1.7 豌豆蛋白抗氧化肽的抗氧化活性测定

对1.6中收集得到的分子量为小于1 KDa、1～3.5 KDa、1～3.5 KDa和大于7 KDa的豌豆蛋白抗氧化肽粉进行O2.- 清除率的测定。

1.8 豌豆蛋白酶解产物分子量分布的测定

用Waters Protein-Pak 125A 300 mm×7.8 mm色谱柱对经透析袋分离后得到的分子量小于1 KDa的组分进行分子量分布的分析。流动相：乙腈/水/三氟乙酸，45/55/0.1（V/V），检测波长：220 nm流速：0.5 mL/min柱温：30℃。

1.9数据分析

每个操作3次平行。利用SAS 9.1软件建立回归模型方程，对数据进行Anova分析，Duncan test确定平均值差异。

2 结果与分析

2.1 响应面法优化酶解物O2.-清除活性实验

在预实验的基础上，固定酶解时间3 h，选取加酶量（A）、温度（B）、pH值（C）、底物浓度（D）为变量，以酶解物的自由基清除率活性为响应值，设计4因素5水平共26个试验点的响应分析实验进行二次回归设计实验和分析。实验方案、实验条件及结果列于表1表2中。

以O2.- 清除率为响应值，经回归拟合后，木瓜蛋白酶酶解豌豆蛋白的O2.- 清除率的回归方程为：O2.- 清除率=-1481+32.2*A+21.7*B+186*C+21.4*D-0.108*AB-1.06*AC+0.377*AD-0.440*BC+0.208*BD+0.394*CD-0.874*A2-0.156*B2-11.4*C2-2.76*D2。

注：-为不显著（P>0.05），*为显著（P<0.05），**为极显著（P<0.01）。

由表3可知，所建模型是显著的，失拟向是不显著的，说明无失拟因子存在，该模型与真实测量值拟合良好。底物濃度、底物浓度的二次项、加酶量的二次项、温度的二次项、pH的二次项影响极显著。说明在木瓜蛋白酶酶解豌豆蛋白过程中，底物浓度、底物浓度的二次项、加酶量的二次项、温度的二次项、pH的二次项对O2.- 清除率有显著影响。由F值可知，F值越大对豌豆蛋白酶解度的影响就越大，所以各因素对豌豆蛋白酶解液O2.- 清除率的影响次序：底物浓度>酶解温度>加酶量>pH。

2.2 最佳自由基清除率条件

以O2.- 清除率为评价指标，对回归方程进行偏微分，得出最佳酶解条件：加酶量12.1%、温度60.2℃、pH 6.46、底物浓度7.15%。在此条件下，得到最佳O2.- 清除率为64.0%。

2.3验证实验

经验证，在此条件下，得到O2.- 清除率为65.3±0.22%。方差分析无显著性差异。这说明该模型预测准确可靠，可用于豌豆蛋白酶解物.O2.-清除率效果预测及酶解条件确定和筛选。

2.4 豌豆蛋白抗氧化肽的分离

对用透析袋分离得到的四个不同分子量的组分肽进行抗氧化化性测定，测定结果见表3。

由表4可知，不同分子量的豌豆蛋白抗氧化肽均具有O2.- 的清除能力，其清除能力随分子量减小而增大。分子量小于1 KDa的清除能力最强。这与文献报道一致。因此后边实验以分子量小于1 KDa的组分为研究材料。

2.5 豌豆蛋白酶解物小于1 KDa组分的分子量分析

2.5.2 分子量小于1 KDa的酶解产物分子量分布图

由图1可知，经1 KDa透析袋分离后的酶解液，分子量大多集中在200～800 Da左右，说明酶解后得到的肽大多是2～8肽，这与相关报道结果一致。

3.结论

木瓜蛋白酶酶解豌豆蛋白最佳酶解条件：加酶量12.1%、温度60.2℃、pH 6.46、底物浓度7.15%。此条件下，最佳O2.-清除率为64.0%。得到了豌豆蛋白木瓜蛋白酶酶解产物自由基清除预测模型，该模型预测准确可靠，可用于豌豆蛋白的生产预测和工艺开发。

参考文献

[1] 张树成， 李玉林. 制取豌豆分离蛋白及淀粉的工艺研究[J]. 农产品加工学刊， 2012， （7） ： 77-80.

[2] 孙旭. 挤压玉米蛋白粉酶法生物活性肽制备及特性[D]. 东北农业大学， 2013.

[3]高群玉， 周俊侠. 豌豆淀粉颗粒性质的研究[J]. 粮食与饲料工业， 1998（ls）：41-42.

[4] Dahl W J， fosterL M， Tyler RT.Review of the health benefits of peas（Pisum.sativum）[J]. BritishJournal of Nutrition，2012， 108（S1）：S3-S10.