稀少精子冻融后行卵胞浆内单精子注射对受精结局的影响

马文叶 程方 刘芳 康卉娴 唐大伟 白刚 任萌萌 金锐

[关键词] 稀少精子;卵胞浆内单精子注射（ICSI）;睾丸精子抽吸术（TESA）;冷冻复苏

[中图分类号] R711.6          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2021）29-0032-04

The effect of intracytoplasmic sperm injection after freezing and thawing of rare sperm on the outcome of fertilization

MA Wenye   CHENG Fang   LIU Fang   KANG Huixian   TANG Dawei   BAI Gang   REN Mengmeng   JIN Rui

Reproductive Center， Yinchuan Maternity and Child Health Care Hospital， Yinchuan   750001， China

[Abstract] Objective To investigate the fertilization outcome of intracytoplasmic sperm injection（ICSI） after freezing and thawing of rare sperm obtained by testicular puncture （TESA） in patients with non-obstructive azoospermia. Methods A total of 200 patients， including the patients with severe oligozoospermia， asthenozoospermia， and teratozoospermia who underwent conventional ICSI on ejaculated sperm and the patients with non-obstructive azoospermia ICSI who underwent ICSI on a small amount of fresh or frozen-thawed sperm obtained by TESA from January 2014 to April 2021 in our center were retrospectively analyzed. They were divided into group A （conventional ICSI sperm group， 107 cases）， group B （frozen TESA sperm group， 35 cases）， group C （fresh TESA sperm group， 58 cases） according to different sperm sources. Through case-control studies， the general clinical data and laboratory data of each group were analyzed and compared. The embryo quality was evaluated. Results There was no significant difference in the number of egg retrieved and egg maturation rate between group B [（11.63±2.87）， 82.31%] and group A （10.81±3.21， 82.63%） and group C （11.46±3.16， 82.41%）（P>0.05）. The normal fertilization rate， normal cleavage rate and high-quality embryo rate of group B （62.99%， 84.83%， 34.64%） were significantly different from those of group A （82.11%， 97.07%， 48.29%） and group C （73.18%， 91.02%， 42.47%） （P<0.05）. Conclusion Intracytoplasmic sperm injection after cryopreservation of rare sperm obtained by testicular sperm aspiration can solve the infertility problem in patients with non-obstructive azoospermia.

[Key words] Rare sperm; Intracytoplasmic sperm injection （ICSI）; Testicular sperm aspiration （TESA）; Cryopreservation

近來，男性精子的数量和质量持续下降，成为造成男性不育的主要因素。有研究显示，男性不育症发病率中精子异常占10%左右[1-2]，其中60%～75%的男性不育患者表现为少精、弱精、无精或精子畸形等[3-4]。目前治疗严重男性不育症最有效的方法首选卵胞浆内单精子注射（Intracytoplasmic Sperm Injection，ICSI）[5]。另外，少弱精子症患者通过射精能得到少量精子，睾丸穿刺术（Testicular Sperm Aspiration，TESA）也可以帮助无精子症患者获得少许睾丸精子[6]，若将这些精子行ICSI或取卵当日冷冻复苏后行ICSI，对减少患者反复睾丸穿刺带来的痛苦及确保取卵当日有足够的睾丸精子授精等有重要意义，或许能够解决精液异常患者的不育难题。据《中国不孕不育现状调研报告》统计，中国现阶段育龄人群中不孕不育人数已超过6000万，从20年前的2.5%～3%上升到现在的15%～20%。其中男方因素约占30%，双方因素约占20%。且每年有40万的取卵周期，8万个ICSI周期;1万左右精子冷冻周期，需求量在逐年上升[7]。因此，男性生殖健康成为近年来新的研究热点，且不孕不育已成为继肿瘤和心脑血管疾病之后的第三大世界医疗难题。

目前由于经过TESA得到的精子数量较少，而且临床上也未能找到合适的稀少精子冷冻方法，所以对于TESA精子的冷冻效果仍有争议[8];TESA精子冻融后行ICSI的受精率等实验室指标及临床妊娠率等，国内外研究报道不一。所以该如何改善稀少精子冻融后行ICSI的受精率和妊娠率是今后研究的主要内容，同时也为稀少精子冷冻技术的发展提供更有利的实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析本中心2014年1月至2021年4月对因严重少、弱、畸形精子症患者射出的精子行常规ICSI及对非梗阻性无精子患者经过TESA得到的少量新鲜或冻融后的精子行ICSI的患者共200例。按精子来源不同分为A：常规ICSI精子组（n=107）;B：冷冻TESA精子组（n=35）;C：新鲜TESA精子组（n=58）。纳入标准：①因男方因素导致的不孕;②女方月经周期规律（28～32 d）且年龄≤35岁;③夫妇双方染色体检查结果正常;④常规临床促排卵（COH）。排除标准：①因子宫畸形或子宫内膜异位症等因素导致不孕;②因输卵管因素导致不孕;③因卵巢功能障碍导致不孕（获卵数≤3枚）。

1.2 促排卵方案

均采用高孕激素状态下促排卵方案或卵泡期长方案，当目标卵泡有2个≥20 mm时，且≥16 mm 占≥14 mm的卵泡数目比>60%时，注射人绒毛膜促性腺激素hCG 5000～10 000后36～38 h，用取卵针在超声下获取卵子。

1.3 精子收集

A组：男方禁欲3～5 d后，取卵当日早晨自行取精，精液用常规实验室方法处理后行ICSI。

B组和C组：①男方在取卵日之前或取卵当天早晨，将经睾丸穿刺手术抽取到的睾丸组织放入装有培养液的培养皿中;②撕碎取出的睾丸组织;③在倒置显微镜下观察，将含有精子的培养液300 G离心20 min后弃去上清，将沉淀弹松后缓慢加入0.2～0.3 mL受精液;④室温静止孵育一段时间后行新鲜TESA精子ICSI，或将TESA获得的稀少精子冻融后行ICSI。

1.4 精子的冷冻与解冻

精子冷冻：将等量的精子冷冻保护剂与TESA精子培养液充分混匀，用巴斯特吸管吸到提前标记好的冷冻麦管内静置3～5 min，液氮熏蒸24 h后投入液氮罐中冷冻保存。

精子解冻：取卵当日解冻精子，从液氮罐中取出精子冷冻麦管，室温放置8～10 min后，放入37 ℃培养箱中，溶解后用洗精液洗涤1次，离心去上清，加入受精液重悬沉淀，孵育一段时间后行ICSI。

1.5 胚胎评分

受精后18～20 h观察胞浆中是否出现正常受精的两原核（2PN）;受精后43～45 h、67～69 h观察胚胎生长情况，对胚胎进行评分。优质胚胎标准：D1为2PN，D2为4细胞，D3为7/8细胞，卵裂球大小均一，细胞碎片≤10%。

1.6 统计学方法

应用SPSS 21.0统计软件，计量资料以（x±s）表示，满足方差齐性时采用独立样本t检验，不满足方差齐性时采用Mann-Whitney检验;计数资料以率[n（%）]表示，采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组临床一般资料比较

三组患者的年龄、不孕年限、激素水平、用药总量和天数等相比，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2 三组行ICSI后实验室指标比较

B组获卵数、卵子成熟率[（11.63±2.87）枚，82.31%]与A组[（10.81±3.21）枚，82.63%]和C组[（11.46±3.16）枚，82.41%]相比，差异无统计学意义（P>0.05）;B组的正常受精率、正常卵裂率、优质胚胎率（62.99%、84.83%、34.64%）与A组（82.11%、97.07%、48.29%）和C组（73.18%、91.02%、42.47%）相比，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

3 讨论

随着现代社会的快速发展，空气污染及空气颗粒物、电磁辐射、生活节奏加快、经济压力增加、遗传因素以及不良的个人生活习惯等导致男性的生精细胞严重损害、不育和不良妊娠结局增多[9]。上海计划生育研究所家庭计划指导与服務中心研究员仇晓莉指出，从理论上来说，只要有一个精子，就有生育的可能，因为一个胚胎是一个精子和一个卵子结合而成的。因此国内外多个生殖中心的专家们都在奋力研究稀少精子的冷冻技术。目前临床上稀少精子冷冻技术在一定程度上能够解决严重少、弱、畸精子症和无精子症患者的不育问题[10-13]。将严重男性不育症患者的少量精子进行冷冻保存，保护不育男性患者的生育权，使患者在婚后仍能获得自己健康的后代，从而维护社会稳定和家庭和谐[14]。上海市第一人民医院李铮教授团队经过数年的不懈努力，终于在2016年报道了我国第1例单精子冷冻试管婴儿诞生，目前已有3例活产[15]。

有研究报道与射精的精子相比，通过TESA得到的精子冻融后行ICSI的优质胚胎率差异有统计学意义[16-17]，这与本研究结果一致。本研究结果显示，冷冻TESA精子组正常受精率、正常卵裂率和优质胚胎率（62.99%，84.83%，34.64%）低于常规ICSI组（82.11%，97.07%，48.29%）和新鲜TESA组（73.18%，91.02%，42.47%），差异有统计学意义（P<0.05）。可能是因为睾丸穿刺手术获得的精子大多数是微微抖动的精子，这些精子不仅没有完全发育成熟，而且精子活动能力差;并且冷冻TESA精子经过冷冻和解冻，由于渗透压变化及冷冻过程对精子细胞膜等的损伤，导致冷冻TESA精子在复苏后精子的活力和膜功能等受到不同程度的破坏[18]。有研究发现，冷冻复苏过程会造成精子DNA损伤，影响精子的运动能力和活力及顶体完整性相关蛋白的表达[19]，这可能是影响受精和胚胎发育的主要因素。但是，对于一些非梗阻性无精子症患者而言，稀少精子冷冻技术目前仍是他们首选且唯一的治疗方案[20]。

由于本中心目前对非梗阻性无精子症患者首先采用经过TESA获得的新鲜精子行ICSI，故冷冻TESA精子组的样本量极少，研究存在一定的局限性，目前还没有妊娠的病例。另有研究分析TESA精子来源于睾丸，没有经历精子运输、获能等一些正常的生理过程，从而促使形态异常的精子与妊娠丢失直接相关;并且稀少精子冻融后行ICSI后产生的子代安全问题仍需要更多的实验和临床深入研究了解，从而为人类的生育力保护事业提供更加有力的支持。

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（收稿日期：2021-04-26）