基于Micro-CT成像对肝癌原位移植瘤血管三维结构的定量研究

刘巧遇 李若坤

肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的发病率和致死率高[1]。血管生成是肝癌的标志，为肝癌的生长、浸润和转移提供基础。抗血管生成是治疗肝癌重要手段之一，以索拉非尼为代表的多种抗肝癌血管生成药物已应用于临床[2]。为评估抗血管生成治疗效果，需对肿瘤功能血管进行可视化和定量表征。组织病理学等常规方法只能展示肿瘤血管的二维结构[3]，无法对血管分支、长度或卷曲度等进行全体积评估，因此，需寻求能更准确定量肝癌血管特征的有效方法。小动物成像Micro-CT具有高的空间分辨率，可对复杂血管结构进行立体成像和结构定量分析，全面展示血管三维结构特征并完整评估肿瘤血管树[4]。

本研究建立肝癌裸鼠原位移植瘤模型，利用Micro-CT联合定量分析量化肿瘤血管三维结构特征，从不同的角度展示肝癌血管生成特点，为进一步明确抑制肿瘤血液供应的潜在途径提供新的思路。

资料与方法

一、实验动物

SPF级Balb/c裸小鼠，雄性，4～6周龄，体质量18～20 g，共20只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验操作与饲养严格无菌。

二、实验方法

(一)原位肝癌动物模型建立 裸鼠随机分为肝癌组(n=10)和正常对照组(n=10)。肝癌组采用MHCC97H人肝癌细胞株进行建模。首先于裸鼠左侧腋窝建立皮下移植瘤，4周后无菌条件下取出肿瘤，去除坏死组织，修剪成1 mm×1 mm×1 mm瘤块，移植入裸鼠肝表面，缝合肝包膜和皮肤，于无菌动物房内继续饲养[5]。正常对照组于肝脏内注射同等量0.9%氯化钠溶液。操作结束后继续饲养21 d。

(二)Micro-CT血管成像 (1)血管铸型：腹腔注射1%戊巴比妥钠(0.01 mL/g)麻醉裸鼠，随后注射3 mL肝素钠溶液(1250 U/mL)，将裸鼠仰卧位固定于固定板上，做胸腹长纵形切口，剪破横膈，暴露肿瘤、心脏及升主动脉根部，丝线结扎左、右上腔静脉及下腔静脉近心端，左心室做小切口，将26G留置针软管经左心室插管至升主动脉口，确认插管及灌注流速满意后丝线固定导管，离断下腔静脉远心端，经导管灌注肝素钠生理盐水20 mL(50 U/mL)，速率2 mL/min，经下腔静脉切口引流，可见肝脏由红褐色转为浅黄色，操作结束后再以4%甲醛5 mL进行血管内灌注固定。新鲜配置Microfli血管造影剂(美国Flow Tech公司)，容量5.6 mL，注射速率0.5 ml/min，经导管灌注至肝脏及肿瘤表面微血管造影剂充填呈小树枝状。操作结束后将标本置于4 ℃冰箱冷藏12 h后剥离裸鼠肝脏。(2)Micro-CT扫描：采用Quamtum GX Micro-CT。将肝脏铸型标本固定于扫描架上，进行360度环形扫描。扫描参数如下：管电压 90 KV；管电流 88 mA；FOV 36 mm×25 mm；空间分辨率50 μm；扫描时间 14 min；成像矩阵：512512。

(三)图像分析 (1)肿瘤分割：采用最大密度投影(MIP)、容积再现技术(VR)重建血管图像。利用mricron软件(v4.0)对Micro-CT获得的图像进行分割，于横断面上逐层勾画肿瘤边缘，利用mevislab软件(v3.3)分割肿瘤与背景肝脏，获得单独的肿瘤影像。(2)血管分割：使用阈值法和区域生长法分割出血管结构。利用影像的灰度直方图，将阈值设置为4600(±50)用于区别血管与背景，阈值设置为3500(±100)用于区别肝脏组织与背景。阈值处理后，使用26-邻域区域生长法获取连通的血管结构和肝组织结构。(3)血管中心线提取：在分割结果的基础上，使用Matlab(R2019a)实现算法[5]。(4)网络化：通过计算中心线上各个点之间的邻接关系，将三维空间上的点映射到二维邻接图(graph)上。(5)量化特征计算：①血管计数类特征：统计血管与组织在影像上的体素个数，可得血管体积与组织体积，血管占比即为血管体积与组织体积之比。利用中心线图进行搜索可得血管分支数及分支长度，这些计数与组织体积的比值可得血管结构的血管分支密度；②血管形态类特征：为了定量血管局部形态变化，计算血管弯曲度特征 Distance Factor (DF)和Sum of angles metric (SOAM)。DF可直观的反映血管的弯曲程度，DF值越大，该血管分支的弯曲程度越大。Bullitt等[6]首次提出了SOAM方法来定量三维血管的弯曲程度，SOAM能从局部出发，反映血管的弯曲程度。

三、统计学分析

采用SPSS 25.0进行统计学分析。比较肝癌与正常肝脏血管的定量参数差异，符合正态性的参数选用两独立样本t检验，否则采用Mann-Whitney非参数检验；P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、血管三维结构

20只裸鼠均完成建模，1只正常对照组裸鼠灌注失败，共有10只肝癌组和9只对照组裸鼠完成实验研究。

结果显示，正常肝脏血管呈小树枝状分叉，分布均匀，走行自然。肿瘤组织血管分布杂乱无章，形态无规则，部分为不规则的囊状扩张，部分为树枝状分支，部分血管异常弯曲，肿瘤血管呈团、呈簇形成复杂的血管网络结构。肿瘤周围可见丰富、扭曲的血管包绕肿瘤，并由外向内渗透性生长，肿瘤内部血管较稀疏，可见大片状无血管坏死区。以上结果表明，Micro-CT血管成像可以实现血管三维可视化，直观显示肝癌、正常肝脏血管三维形态特征(图1，2)。

图1 MHCC97H肝癌肿瘤Micro-CT成像二维图 A：肝癌Micro-G图像横断面；B：肝癌Micro-CT图像冠状面

图2 三维重建图像 A为MHCC97H肝癌原位移植瘤三维重建图像； B为经分割去除肝脏组织后肿瘤的血管三维重建图像； C为正常肝脏血管三维重建图像

二、血管定量参数

与健康肝脏血管相比，肝癌的血管占比、血管分支密度明显降低，差异有统计学意义；与健康肝脏血管相比，肝癌血管的平均半径缩小、平均SOAM增加，差异有统计学意义，表明肝癌内部多为细小、扭曲的血管；肝癌血管的平均血管分支长度略小于健康肝脏，差异无统计学意义 (P>0.05)。见表1。

讨 论

本研究基于Micro-CT成像揭示了肝癌裸鼠原位移植瘤血管的三维结构形态，并从密度和形态两方面描述了血管特征。肝癌血管结构在大体形态和定量特征参数上均表现出与正常肝脏的明显异质性。正常肝脏血管分布均匀、走行自然，而肝癌血管结构混乱。肿瘤的血管生成进展十分复杂：在早期，血管密实而丰富，随着肿瘤体积增加，其内部出现缺血性坏死，在图像中表现为没有造影剂的灌注，这导致血管体积比例相对较低。文献报道，与生长缓慢的肿瘤相比，生长迅速的肿瘤血管更细小，血管分支的总数更低[7]，与本研究中肝癌血管分支密度的降低一致。研究表明，由于肿瘤血管直径小于健康组织，血管直径可用于区分健康组织和肿瘤组织[8]。三维图像显示肝癌血管较正常肝脏血管扭曲，用平均DF、平均SOAM两个形态学参数来定量血管的曲折度，将抽象的图像信息转化为具体的特征数据。肿瘤组织的曲折度更大，可用于识别良性和恶性肿瘤[6]，本研究结果也通过平均DF和SOAM得出一致的结论。

Micro-CT是一种非破坏性的3D成像技术，以超高的空间分辨率可视化血管的三维结构形态，具有易于准备，成本低及血管形态表征等优势，在大鼠肺血管的Micro-CT所显示的血管直径最高分辨率为12.5 μm，临床常用的血管成像技术如CTA、MRA等均不能显示类似直径的血管[9-11]。血管定量分析是以量化的数据来描述抽象的血管病变程度。Micro-CT联合血管铸型重建组织血管结构，结合血管定量分析方法量化血管特征是近几年的研究热点，广泛应用于肺血管、肾脏疾病、肝血管及肝纤维化等各个组织及系统[12]。Debbaut等[13]对利用血管腐蚀铸型方法和Micro-CT对人肝脏血管进行形态学分析，可显示肝血管树的13级分支，肝血管的半径从13.8 mm到80 μm不等，血管长度从74.4 mm到0.74 mm不等。

此外，采用人肝癌细胞系建立的裸鼠肝原位移植瘤模型可以很好地模拟人肝癌的解剖学特征。在定量分析中选择整个肿瘤区域作为ROI，避免了因区域选择不充分而导致的错误，相比免疫组织化学方法获得了更准确的结果。

表1 小鼠正常肝脏和肝癌的血管定量参数对比结果(±s)

本研究也有一些局限性。首先，手动划定肿瘤边界的瘤体提取方法有待进一步优化；其次，肿瘤中的一些血管可能未连接到中心血管树，从而导致灌注过程中的填充不足；最后，实验的样本量较小。

基于Micro-CT成像，该研究展示了肝癌原位移植瘤血管的三维结构，通过量化肝癌和健康肝脏的血管特征差异，可以进一步明确抑制肿瘤血液供应的潜在途径。