肝脏MRI联合血清DKK1、GPC3、FOXP3、CXCL13和AFP检测诊断肝细胞癌价值分析

冯硕 昝立山 马军 李凡 贾建伟 李增军

临床上，主要依靠影像学联合血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)检测诊断肝癌，但其他肿瘤或良性肝病也可出现血清AFP升高，且有部分HCC患者血清AFP阴性或水平较低，影响了诊断的灵敏度[1]。因此，探索新的联合诊断指标非常必要。分泌型蛋白Dikkopf-1(DDK1)是Wnt信号通路的抑制因子[2]；人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC3) 是一种硫酸乙酰肝素糖蛋白，在HCC中高表达，可激活Wnt信号通路，促进癌细胞增殖[3]；转录因子FOXP3在多种肿瘤表达，可抑制肿瘤的免疫微环境[4]；趋化因子CXCL13是人体免疫系统的重要组分，参与肿瘤细胞的各种病理学进程[5]。本研究探讨MRI联合血清DKK1、GPC3、FOXP3、CXCL13和AFP检测诊断HCC患者的价值。

资料与方法

一、一般资料

2017年1月至2018年6月北京朝阳医院住院的HCC患者80例，其中男59例，女21例；年龄30～75岁，平均年龄为(55.3±15.8)岁。纳入标准：①诊断标准符合《原发性肝癌诊疗规范(2011年版)》[6]；②患者均接受活组织检查或手术中病理检查确诊为HCC。排除标准：患有自身免疫疾病，严重的心、肺、肾疾病。选取确诊经MRI或CT或组织病理检测确诊的肝硬化、慢性肝炎患者作为良性肝病组，男40例，女20例；年龄31～74岁，平均年龄为(56.5±16.7)岁。诊断标准：门脉高压，肝功能不全ALT、AST、胆红素异常，反映肝纤维化的血清指标增高，出现腹水，影像学检查显示肝硬化征象。健康体检者60例为对照组，男42例，女18例；年龄32～72岁，平均年龄为(53.5±17.2)岁。受试者及其家属签署知情同意书，本研究经医院医学伦理委员会批准。

二、检测方法

空腹抽取静脉血5 mL，静置30 min，4000 r/m离心10 min，-25℃保存待检。采用ELISA法检测血清DKK1、GPC3、CXCL13 和FOXP3水平(DNM-9602G酶联分析仪和上海恪敏生物科技有限公司试剂)。

三、MRI检查

使用西门子3.0 T TrioTim(德国)超导磁共振诊断仪和腹部相控阵线圈。患者取仰卧位，头先进，行冠状位T2WI-haste(TR=2000 ms，TE=90 ms，矩阵=320×256，层厚4.9 mm，层间隔1.5 mm)、同反相位T1W1-flash (TR 210 ms，同相位TE=2.45 ms，反相位TE=3.83 ms)、脂肪抑制四期动态增强T1Wl-vibe(TR 3.48 ms,TE 1.28 ms,矩阵320163，FOV 360 mm×281 mm，层厚4 mm)，脂肪抑制轴位T2W1-tse(TR 4700 ms,TE 108 ms,矩阵320×320，FOV 360 mm×360 mm，层厚6 mm，层间隔1.5 mm)及冠状位T1WI-vibe(TR 3.48 ms,TE 1.28 ms,矩阵320×163，FOV 360 mm×281 mm，层厚4 mm)，动态增强在第一期平扫之后完成，使用高压注射器在患者肘正中静脉团注Gd-DTPA 0.2 ml/kg，打药速度3 ml/s,随后用15 mL生理盐水冲洗，在打药后15 s、30 s及60 s分别采集动脉期、门静脉期及静脉期，冠状位增强扫描在打药后3 min扫描。诊断HCC的标准：小肿瘤(直径≤3 cm) 在T1和T2加权像分别为低信号和高信号区，40%病灶可见为圆形、类圆形假包膜，境界清楚，信号均匀；大的肿瘤(直径大于3 cm)在T1加权像呈稍低信号，在低信号区有高信号存在提示瘤内出血，在低信号区内有更低的信号则提示存在肿瘤液化坏死；在T2加权像上，肿瘤信号稍高，不均匀。多有假包膜、血管受侵、子瘤结节；弥漫性肝肿瘤在T1和T2加权像分别为多发低信号和高信号区，多为结节状，大小不等，境界不规则。

四、统计学分析

结 果

一、 肝细胞癌MRI表现

肝右叶上段可见斑片状异常信号，DWI序列病灶弥散受限(图1A),T1WI呈等信号(图1B)，T2WI呈稍高信号(图1C),增强扫描后动脉期呈明显强化(图1D),门脉期(图1E)及延迟期(图1F)强化程度减低。

A: DWI；B:T1WI；C:T2WI；D: 动脉期；E: 门脉期；F: 延迟期

二、 各组血清DKK1、GPC3、FOXP3、CXCL13和AFP水平比较

肝癌组血清DKK1、GPC3、FOXP3、CXCL13和AFP水平显著高于良性肝病组(P<0.05)，而后者又显著高于健康人(P<0.05)，见表1。

三、诊断价值对比

MRI技术及血清DKK1、GPC3、FOXP3、CXCL13、AFP肝癌诊断的灵敏度、特异度分别为(88.8%,76.7%)、(95.0%,85.0%)、(91.3%,80.0%)、(85.0%,71.7%)、(93.7%,81.7%)、(81.3%,56.7%)，DKK1的诊断灵敏度与特异度在各项检测指标中最高。

讨 论

MRI联合血清标志物检测可增加HCC诊断的准确性[7]。DKK1、GPC3、FOXP3、CXCL13、AFP均是HCC的标志物，在肿瘤组织及外周血均呈现出高表达，推测同MRI联合检测可能会提高诊断的准确度。

DKK1结构上含一个信号肽序列，2段富含半胱氨酸的保守结构域，DDK-N和辅酯酶折叠，在HCC中呈现高表达，可通过DKK-1/Wnt/β-catenin轴促进HCC细胞的增殖和迁移[8]。研究发现，GPC3在肝母细胞瘤、肾母细胞瘤等多种肿瘤存在一定程度表达，此外GPC3在肝硬化进展期其血清也有一定水平，GPC3可通过激活经典Wnt信号通路促进HCC细胞的生长[9]。FOXP3在HCC中高表达，体外细胞培养实验显示FOXP3 mRNA及其蛋白在大多数癌细胞株中高表达，阳性率可达80%以上，在低转移细胞株表达<20%，免疫微环境在HCC发展中发挥重要作用，FOXP3是Treg的特异性标志，表达FOXP3的Treg细胞具有免疫抑制作用[10]。CXCL13 来源于人体淋巴组织和树突状细胞，参与肿瘤细胞的各种病理过程，对细胞增殖发挥作用，研究显示其与肿瘤的发生和转移具有相关性，在乳腺癌、肺癌、HCC中等多种癌症的增殖和转移中均发挥作用[11]。本研究中，肝癌组和良性肝病组DKK1、GPC3、FOXP3、CXCL13含量均较对照组高，符合4种因子作为血清标志物的临床特点。

血清 AFP是临床公认的诊断HCC的重要指标，HCC患者的肝癌细胞会产生和分泌大量 AFP进入到血液循环中，因而血液中AFP 水平较为稳定并对HCC的特异性较强[12]。但也有大量的临床研究结果显示，血清AFP 的HCC诊断敏感度、特异度不高，不少肝硬化、肝炎等非肝脏肿瘤患者的血清AFP水平也存在异常升高现象[13]。研究显示DDK1与AFP联合检测可显著提高诊断准确率，而GPC3与AFP联合检测也可提高诊断准确率[14]。本研究中，MRI技术及血清DKK1、GPC3、FOXP3、CXCL13、AFP检测准确度分别为88.8%、95.0%、91.3%、85.0%、93.7%、81.3%，说明五种标志物均有很高的诊断价值。本研究检测的五种标志物，MRI和DKK1均可对Wnt信号产生影响，能直观反映细胞增殖情况，FOXP3、CXCL13和AFP则对细胞免疫微环境产生影响，反映了机体免疫情况，检测指标涉及的范围较为全面，且在配合MRI的基础上联合诊断，能够有效的提高HCC的诊断准确率。

综上所述，MRI技术联合检测血清DKK1、GPC3、FOXP3、CXCL13、AFP可以提高对原发性HCC的检出率，具有较高的临床应用价值。

表1 各组血清DKK1、GPC3、FOXP3、CXCL13和AFP水平比较(±s)