总巯基检测试剂比色法研究进展

2021-01-11张雪霁

化学分析计量 2021年9期

张雪霁

（天津大学药物科学与技术学院，天津 300072）

巯基化合物通过氧化还原反应参与机体代谢，进而影响机体的正常生理功能，其涉及范围广，种类多，然而目前鲜少有文章系统地总结含巯基物质的定量测定方法。5-5’二硫代双（2-硝基苯甲酸）通常指总巯基检测试剂，又称作Ellman 试剂或简称为DTNB，现已成为实验室常用的一种巯基定量检测试剂。总巯基检测试剂比色法首次被Ellman 提出，又被叫做Ellman 法，Ellman［1］于1959 年成功合成DTNB，并通过光电比色法定量地测定了生物材料（血液样品）中的巯基，其简便、有效和快速的优势使得Ellman 试剂被广泛使用。在弱碱性条件下，反应物中巯基（—SH）的数量，可根据硫醇类物质的—SH 与DTNB 的二硫键快速交换释放的2-硝基-5-硫代苯甲酸二价阴离子（NTB2-）来计算，此阴离子的最大吸收波长为412 nm，其摩尔消光系数为14 150×1 000 cm2／mol。此外，随着分析技术的发展，Ellman 试剂还可以与高效液相色谱联用以实现实时监测，或者作为表面增强拉曼光谱的探针以达到增强信号的作用。笔者将对Ellman 法的反应原理、反应动力学性质进行概述，并着重介绍其应用，旨在为该方法能够更加灵活广泛地运用到相关研究中提供解决思路和参考。

1 反应原理

DTNB 与含有巯基的物质（R—SH）在弱碱性条件下反应，生成一分子NTB2-和一分子R—S—S—NTB。NTB2-显亮黄色，可通过监测412 nm波长下的吸光度根据朗伯-比耳定律进行定量。NTB2-摩尔消光系数的确定经历了20 年，最开始的摩尔消光系数ε412(13 600×1 000 cm2／mol)是由Ellman［2］将NTB2-溶解在丙酮中测量得到的。此后，有科学家采用过量的半胱氨酸、巯基乙醇和还原型谷胱甘肽与DTNB 反应［3-4］，并对ε412进行了测量，得到ε412范围为（9 500～13 100）×1 000 cm2／mol。直到1979 年，Riddles 等［5］从反应溶液的pH、离子强度和温度等当方面重新评估了NTB2-的摩尔消光系数，得到延用至今的14 150×1 000 cm2／mol。

2 反应动力学性质

巯基-二硫键的交换是以硫负离子（RS-）作为进攻基团发生的二级亲核取代（SN2）反应。Vasas等［6］在研究硫化氢的二硫键还原电势动力学和热力学性质时，以DTNB 作为二硫化物的模型，综合性地探讨了DTNB 与硫醇类化合物反应时的动力学性质。在Ellman 试剂反应中，当DTNB 的化学计量数是硫醇类化合物的100 倍时，一分子的DTNB释放一分子的NTB2-，此反应呈现依赖于硫醇类化合物的伪一级动力学过程。当硫醇类化合物的化学计量数是DTNB 的100 倍时，一分子的DTNB 释放两分子的NTB2-，此时也符合伪一级动力学性质，Vasas 认为这可能是由于一组独特的动力学参数所产生的简单动力学行为。此外，该反应显示出强烈的pH 依赖性，其反应的最佳pH 范围是7～8。

影响DTNB 反应活性的因素主要有两个，包括硫醇类物质的pKa 和空间位阻。与DTNB 反应的最佳巯基类物质的pKa 应与此反应的最适合的pH范围相一致［7］。牛血清蛋白有一个相对暴露的巯基基团，而β-乳球蛋白的巯基因自身构象原因而高度掩蔽，这种空间结构上的差异造成了反应活性的不同。对于蛋白中的巯基而言，其反应活性还受蛋白结构的调节。诱导效应是由于临近的带电荷的氨基酸之间相互作用而产生的，因此多肽链长度增加，诱导效应的强度就会降低［8］。钙离子结合引起的肌钙蛋白C 构象的改变也会引起巯基基团反应活性的改变［9］。

3 Ellman 法的应用

3.1 巯基活性测定

在许多应用学科中，巯基的定量测定成为一项常规操作，而快速、简便的方法便成为首选。随着化学合成技术的发展，出现了DTNB 的替代品——4，4’-二硫代二吡啶(4-DPS)［10-11］。4-DPS 的优势是可以在相对低的pH 范围内（pH 3～7）进行巯基定量，避免不必要的副反应。但4-DPS 与巯基产生吡啶酮产物的最大吸收波长为324 nm，相比于NTB2-的最大吸收波长较短，这意味着DTNB更具稳定性，更适合于近紫外区强吸收溶液中巯基的定量。此外，在中性环境中，4-DPS 的溶解度远低于DTNB，这一点在实际应用中也要被考虑在内。

多种分析技术如高效液相色谱（HPLC）、气相色谱-质谱联用（GC-MS）和毛细管电泳（CE）已被报道用于复杂生物体中的低分子量硫醇的检测［12］。高效液相色谱技术分辨率和灵敏度较高，已被应用于多种领域，并已成为解决生化问题最有前途的方法之一。Ozyurek 等［13］建立了HPLC-Ellman法测定了L-半胱氨酸、还原型谷胱甘肽和N-乙酰半胱氨酸等小分子硫醇的活性。经C18柱分离的硫醇与柱后试剂DTNB 反应，使用二极管阵列检测器进行监测，检测限可低至40 nmol／L。Furuki 等［14］利用分子排阻-超高效液相-Ellman（SE-UHPLCEllman）法测定了单克隆抗体中的硫醇含量。与上述提到的HPLC-Ellman 法类似，SE-UHPLC 用于单克隆抗体的分离，柱后流出液与DTNB 反应，经紫外检测器检测，显示出良好的选择性、线性和重复性。这种与高效液相色谱联用的Ellman 法具有快速、价廉、通用、不费力等优势，可推广用于生物样品和药物中硫醇成分的定性以及定量估计。

除此之外，Ellman 试剂也可单独用于测定多种物质中的巯基活性，小到硫化氢气体分子，大到蛋白质类有机大分子。由于硫化氢是气体，难以捕捉和测量，操作不便，因此设计硫化氢供体成为新的研究方向。Zaorska［15］等设计了硫酰胺类、硫内酰胺类和硫脲类等化合物作为硫化氢供体，并用DTNB 作为硫化氢释放试验中的反应试剂，定量测定了硫化氢释放的动力学参数。微管蛋白是一种富含巯基的异二聚体，在哺乳动物脑微管蛋白的两个亚基上共分布20 个半胱氨酸残基。虽然这20 个半胱氨酸残基均是还原型，但其反应性并不完全依赖于表面的暴露性，因为一些更隐蔽的半胱氨酸残基有较高的反应性［16］。微管蛋白可以结合大量对其产生影响的不同结构的小分子，这些小分子的结合造成微管蛋白结构上的动态变化，尤其是微管蛋白上半胱氨酸的反应活性［17］。其中，秋水仙碱已被证明可通过改变微管蛋白的结构，使得半胱氨酸残基失去与DTNB 的反应活性［18］。Ellman 法简便易行，不依赖于配体的放射性或荧光性质，可提高配体筛选效率，因此Begaye 等［19］利用DTNB 来检测和评价配体结合后的微管蛋白，以进一步推断配体结合特征。

综合比较发现，尽管有各种各样的分析手段，但是，Ellman 试剂依然是经典且常用的巯基检测显色剂，在巯基的活性测定方面有着不容忽视的重要作用。

3.2 胆碱酯酶活性测定

胆碱酯酶活性测定方法主要包括羟胺-三氯化铁法［20］和Ellman 法［21］两种，其不同点在于羟胺-三氯化铁法测定的是未被胆碱酯酶分解的乙酰胆碱，而Ellman 法测定的是被乙酰胆碱酯酶（AChE）分解后的硫代乙酰胆碱。对比而言，硫代乙酰胆碱与其水解产物成比例，因此Ellman 法在胆碱酯酶活性测定上显得更为直接。

胆碱酯酶的活性中心有两个：带负电荷的阴离子部位和酯解部位，其抑制剂可逆（毒扁豆碱）或不可逆（有机磷化合物）地降低酶活性。有机磷化合物通过与活性位点的丝氨酸结合抑制乙酰胆碱酯酶活性［22］，但肟类化合物可通过亲核反应，攻击磷酰化的丝氨酸残基，使其去磷酰化恢复乙酰胆碱酯酶活性［23］。因此，Ellman 法可用于胆碱酯酶抑制剂的筛选和肟类化合物重活化能力的评估。而且，有机磷化合物、肟和乙酰胆碱酯酶之间相互作用的体外动力学研究为评估体内动力学提供了重要参考依据。

3.2.1 胆碱酯酶抑制剂筛选

胆碱酯酶抑制剂来源广泛，既有化学合成物也有天然产物。天然产物种类繁多，Ellman 法可以快速地实现其最优抑制剂的筛选，从而节省时间成本。赖东海［24］在研究生物碱类的乙酰胆碱酯酶抑制剂时，提取了22 种植物的总生物碱，并用Ellman 法对提取物进行抑制活性筛选，这为以后开发出具有价值的活性先导物提供了依据。基于多奈哌齐的结构，胡玉恒等［25］设计了芳基香豆素类衍生物，随后利用Ellman 法测定了被合成物质对胆碱酯酶的抑制率。综合以上及其它类似的胆碱酯酶抑制活性筛选［26］，Ellman 法是相关研究中使用频率较高，被科研人员所认同的活性测定方法。

3.2.2 肟重活化能力的评估

肟对被抑制的乙酰胆碱酯酶再活化的能力研究，是乙酰胆碱酯酶体外活性动力学的重要应用之一［27］。张轶辉［23］以Ellman 法为主要检测手段，系统地评价了3 种肟类化合物及其不同浓度对乙酰胆碱酯酶的重活化作用。肟的重活化反应较为复杂，需要考虑各种各样的干扰因素，比如未反应的有机磷化合物、有机磷化合物的自发脱烷基不可逆地抑制乙酰胆碱酯酶，以及具有极高抑制性的磷肟副产物的产生等。简单来说，针对肟的亲和性和反应活性的差异性，大致可遵循两种可调节的实验方案：间断测量［28］和连续测量［29］。当肟的亲和性较低时，采用高浓度的肟与被抑制的乙酰胆碱酯酶、DTNB在缓冲液中孵育，每隔一定时间间断监测NTB2-。当肟的亲和性高时，由于反应过快不易操控，间断测量不再适用，此时可在短时间内连续测量NTB2-，依据依赖于浓度的曲线，进行非线性回归分析。

3.2.3 在线监测分析系统的开发

Eckert 等［30-32］开发了一种动态的体外模型，可实时监测膜结合的乙酰胆碱酯酶活性，并成功地运用到评价不同种类肌肉匀浆的有机磷化合物、氨基甲酸酯和肟的动力学。动态的实时监测是通过将8种不同的溶剂，如缓冲液、底物、显色剂、有机磷化合物（抑制剂）和肟（再活化剂），连续或同时地泵入酶反应器，流出液被输送到紫外-可见光检测器，实现在线实时记录吸光度。这种基于Ellman 法的系统，不仅可以在线记录在有抑制剂及再活化剂存在下乙酰胆碱酯酶的活性，还可以计算后续的动力学参数。

3.3 应用于表面增强拉曼光谱

表面增强拉曼光谱（SERS）是一种强大的光谱技术，可用于分析生物样品和分子结构，以及检测低浓度的分析物或者污染物。许多由银、金、铜、锂等金属材料制成的具有SERS 活性的底物可显著增强其信号响应。DTNB 是拉曼活性信号分子之一，已成功地被用作基于SERS 的免疫分析和诊断技术的探针。

Kaminska 等［33］以DTNB 修饰的金纳米粒为探针，开发了基于SERS 的免疫分析方法，并成功地检测了人血浆中的白细胞介素-8（IL-8）。Pang等［34］以Fe3O4＠Ag-DNA-Au＠Ag＠DTNB 偶联物为SERS 探针，提出了一种用于检测外周血和上清血浆中microRNA-10b 的一步检测法，为胰腺癌的诊断提供了依据。通过对患者外周血和上清血浆中microRNA-10b 的定量分析，可以准确地区分胰腺导管腺癌与慢性胰腺炎和正常对照组，这也为之后检测多种microRNA 提供了可能性。

快速、灵敏地诊断细菌感染，对食品安全监测和临床治疗具有重要意义。Wang 等［35］基于M13噬菌体构建了SERS 模型来进行选择性检测和灭活金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌特异性的SERS探针是通过在M13 噬菌体表面原位生长金纳米粒子（AuNPs），然后用DTNB 在金纳米粒表面修饰构建而成。加入该探针后，M13 噬菌体选择性地与金黄色葡萄球菌结合，诱导AuNPs 锚定在金黄色葡萄球菌表面，并标记金黄色葡萄球菌细胞，离心收集用于SERS 检测。此检测方法对金黄色葡萄球菌显示出了高选择性和高灵敏度。

此外，Tanis 等［36］也使用由DTNB 修饰的金纳米粒作为SERS 探针快速地计数大肠杆菌。随着时代的发展，越来越多的技术和分析方法可用于细菌检测，比如荧光光谱、表面等离子体共振、酶联免疫吸附测定、酶联免疫聚合酶联反应和石英晶体微电化学方法等。相比于其它分析方法，Tanis 等［36］开发的基于SERS 的光谱方法，具有更经济、更快速、高灵敏度的特点。此外，通过使用不同的抗体，该方法还可用于定量检测其它复杂基质（全血、血清、尿液或食物基质等）中的多种靶点。

3.4 新二硫键的形成

巯基-二硫键的交换方法是一种有力的手段，因为它提供了将报告分子、阻断基团和交叉连接部分引入蛋白的可能性。近年来，Guo 等［37］采用两步硫醇-二硫键交换过程，引入了新的二硫键，包括巯基修饰的非病毒蛋白衣壳（与DTNB 反应生成的蛋白衣壳和NTB2-的偶联物）和巯基修饰的客体分子与上一步偶联物反应，成功实现了姜黄素的包封，后续客体分子很容易在还原条件下，从非蛋白衣壳内释放出来，形成了一个良好的载药-释放系统。相比于游离的姜黄素，被蛋白衣壳包封的姜黄素有较高的溶解性，提高了药物的生物利用度。目前，药物递送系统正是热点话题之一，提高载药率无疑是对药物递送系统的重大挑战。上述研究证明了Ellman 试剂是良好的中间反应试剂，可推广用于其它载体对药物的包封，比如类病毒颗粒和各种纳米颗粒等。