菲牛蛭体成分和养殖技术的研究进展

■陈 琛戚 敏杨秀娟

（1.云南农业大学动物科学技术学院，云南省动物营养与饲料重点实验室，云南昆明 650201；2.云南省畜牧总站，云南昆明 650225）

菲牛蛭（Poecilobdella manillensis），别名马尼拟医蛭，俗名金边（铜边）蚂蟥，属环节动物门，蛭纲，医蛭科，牛蛭属，高等无脊椎动物，雌雄同体；体形较大，体长为107～113 mm，宽为8～12.5 mm；以吮吸人与家畜等脊椎动物血液为生，在国内分布于广东、海南岛、广西、福建等地区，在国外分布于印度、越南、泰国、菲律宾等国家，喜生活在沟渠、稻田、沼泽、池塘等湿热环境中[1-3]。

水蛭是一味传统中药材，初载于《神农本草经》，有破血、通经、散瘀的功能；主治血瘀经闭腹痛、症瘕积聚，跌打损伤[4]。水蛭体内最主要的活性成分是水蛭素（Hirudin），是迄今为止发现的自然界最强特异性抗凝血物质，广泛的存在于吸血水蛭唾液腺及唾液中，其药效上优于重组水蛭素（Recombinant hirudin,rH）和肝素，副作用低于重组水蛭素和肝素[5-6]。菲牛蛭是水蛭的一种，体内含有水蛭素、菲牛蛭素（Bufrudin）、纤溶酶、透明质酸酶，血小板聚集抑制剂等多种活性成分，具有抗凝血、抗肿瘤、抗炎、降血脂等作用[7]，且菲牛蛭提取物的抗凝血酶活性高于其他水蛭[8-9]，在医学上有着广阔的应用前景。近年来，由于人们对心血管药物的迫切需求，以及天然水蛭素的不可替代性，人们开始重视对菲牛蛭有效成分和养殖技术的研究，本文对菲牛蛭的体成分以及养殖技术研究进行综述，为菲牛蛭的养殖和开发提供参考。

1 菲牛蛭体营养成分

菲牛蛭粗蛋白含量为16.7%、灰分为1.33%、粗脂肪为1.35%、水分为80.55%，粗蛋白含量较高，粗脂肪含量低[10]。苗艳丽等[11]测定了菲牛蛭体18种氨基酸含量，含量最高的非必需氨基酸为甘氨酸，达5 535.28μg/g；必需氨基酸为亮氨酸，高达2 340.59μg/g。甘氨酸在机体某些病理条件下表现出抗损伤、抗炎、免疫调节的作用[12]。而天冬氨酸、甘氨酸、亮氨酸在菲牛蛭活血化瘀的功效中也起到了十分重要的药理作用[11]。菲牛蛭氨基酸组成比例中必需氨基酸与总氨基酸的比值（EAA/TAA）为36.87%，必需氨基酸与非必需氨基酸的比值（EAA/NEAA）为58.41%，符合FAO/WHO推荐值，具有良好的氨基酸组成比；药用氨基酸（MAA）总含量为43.44%，其中包括天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、精氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸，药用氨基酸与总氨基酸的比值（MAA/TAA）达65.73%，药用氨基酸含量高[10]。

菲牛蛭16种脂肪酸，占脂肪酸总量的97.39%，其中饱和脂肪酸占63.34%，不饱和脂肪酸占34.05%，含量最高的脂肪酸是十六烷酸（棕榈酸），达到23.78%，其次是9-十八碳烯酸（油酸），占12.53%[10]。棕榈酸能降低血清中的胆固醇含量，是细胞膜中磷脂的重要组成成分，而油酸具有提高血液中高密度脂蛋白的作用，能够有效预防心脑血管疾病[13-15]。

菲牛蛭体成分含有Ca、Fe、Mg、Mn、Zn、Cu、V、Cr 8种元素，在测定的元素当中，其常量元素中Ca的含量最高，为14.11 mg/g，微量元素中Fe与Zn的含量最高，分别为1.33 mg/g和1.37 mg/g，且菲牛蛭体内的Fe、Mg、Zn微量元素符合抗癌药物微量元素范围[16]。

2 菲牛蛭的活性成分

2.1 水蛭素和菲牛蛭素

水蛭素是存在于水蛭唾液腺里的一种重要活性成分，是由65～66个氨基酸残基组成的小分子单链环肽化合物，相对分子质量为7 000 u。水蛭素具有抗凝血和抗血栓的作用，其抗凝作用专一且抗凝活性强于肝素，是一种特异性最强的天然凝血酶抑制剂。而重组水蛭素由于第63位氨基酸Tyr无硫酸基团，导致重组水蛭素对凝血酶的抑制效果较水蛭素低90%，血清半衰期短，并且伴有严重的副作用[5-6，17]。重组水蛭素的这一缺陷，导致了天然水蛭素具有了不可替代性。菲牛蛭素是从菲牛蛭唾液中分离得到的多肽类化合物，可以与凝血酶相结合，有抑制凝血酶的效果[18]。黎渊弘[19]通过实验得到菲牛蛭素是由cDNA长度为251 bp，编码框由20个氨基酸信号肽和63个氨基酸成熟肽构成的。菲牛蛭素中含有两种主要的特异凝血酶抑制物——菲牛蛭素A（Bufrudin A，BDA）与菲牛蛭素B（Bufrudin B，BDB），且两者作用的凝血因子稍有不同，且抗凝血酶指标存在差异性。黄爱民[20]从菲牛蛭中成功分离纯化出菲牛蛭素并分离出BDA与BDB。BDA分子量约为15.2 ku，等电点为3.97，BDB分子量为14.6 ku，等电点为4.61；两者均能作用于Ⅱ、Ⅷ、Ⅻ型凝血因子，均不能作用于Ⅴ、Ⅸ、Ⅺ型凝血因子，但BDB还能作用于Ⅹ型凝血因子。

菲牛蛭唾液中同时含有天然水蛭素和菲牛蛭素，但菲牛蛭素和水蛭素是两种不同的物质。菲牛蛭素氨基酸序列50%～60%和水蛭素氨基酸序列相同，其余氨基酸序列不同[18]，且BDA和BDB的分子量与水蛭素均不同，可知是不同的抗凝血物质。除了分子量（Mr）与报道的水蛭素分子量（Mr）相差较远外，BDA等电点（3.97）与水蛭素相似；而BDB等电点（4.61）则比水蛭素大，其他的生化指标及抗凝活性行为均与报道的水蛭素极为相似[21]。

2.2 其他活性成分

菲牛蛭还含有纤维蛋白溶解酶、抗血小板聚集活性成分，新型抗凝血酶活性多肽。钟小斌等[22]从菲牛蛭消化液中分离出一种纤维蛋白溶解酶，其相对分子量为42 ku，其纤溶机理可表现为直接溶解纤维蛋白。李文等[23]通过抗ADP或胶原诱导的血小板聚集实验发现，菲牛蛭具有抗血小板聚集的作用，说明菲牛蛭含有抗血小板聚集的活性成分。例如：水蛭素以及变异体家族能够抑制凝血酶[24]；Antistasin[25]、Therostasin[26]和Tridegin[27]能够对凝血因子产生抑制作用；Decorsin[28]、ORnatin[29]能够颉颃血小板糖蛋白；Ga⁃lin[30]、Lapp[31]能够抑制血小板聚集等；Hementin[32]能够溶解血栓蛋白。

卢舒凡等[33]利用水提醇沉、离子交换、反向层析法分离纯化菲牛蛭，所得菲牛蛭抗凝活性多肽抗凝活性≥2 548 000 ATU，并发现粗提物经过电泳分离的蛋白条带在CBNI数据库未找到相似蛋白，说明该研究的目的蛋白和已发现的“菲牛蛭素”不同，属于新型抗凝蛋白。肖凌[34]通过胰蛋白酶酶解菲牛蛭和日本医蛭冻干粉，从日本医蛭中得到3种抗凝血酶多肽，从菲牛蛭中得到6种，其中有4种是日本医蛭所没有的。

3 菲牛蛭生长发育以及繁殖特性

3.1 菲牛蛭的生长发育特性

菲牛蛭是一种料重比比值小、体质量大的水蛭。菲牛蛭具有3个生长发育阶段，从活兔身上吸食血液，吸血第1、2、3次为幼体阶段，吸血第4次以后为亚成体阶段，吸血第5次部分个体性成熟，第6次全部性成熟，总体历经14个月，在菲牛蛭环带区的生殖孔附近出现米黄色颗粒，即性成熟后成为成体。菲牛蛭幼体重为1.27～3.35 g，亚成体3.35～11.7 g，成体11.7～20.2 g，性成熟吸血量为：103.15 g/10条，且生命周期最大体重是性成熟体重的3倍，料重比为3∶1，而蚂蟥（日本医蛭）的料重比为5.6∶1[35]。

3.2 菲牛蛭的繁殖特性

菲牛蛭是一种雌雄同体的环节动物，异体交配，雄性生殖器一般性成熟较早，繁殖过程一般为：交配、产卵、孵化三个阶段，幼蛭第一年8月孵化后，于次年春季性成熟[36]。。

菲牛蛭能够在土壤、水中进行交配，且在土壤环境条件下的交配率高于水体环境。受到温度的影响，菲牛蛭在30℃的条件下有最高交配率，为97.780%；菲牛蛭水体交配率较低，即使在最适水体温度下交配，其交配率也不超过70%[37]。菲牛蛭的交配大约一月后开始产卵茧，一般在春季进行，当水温大于20℃时，菲牛蛭成蛭会爬离水面20～30 cm，在土壤中产卵茧；卵茧在20～30℃条件下，经过2～3周的时间即可孵化出幼蛭，菲牛蛭成蛭每次产卵1～5个，平均3.2个，每个卵茧可孵化幼蛭1～25条，平均11.6条[38]。卵茧克数为1.0～1.5 g和1.5～2.0 g时，孵化率和孵化数最高，其最适孵化温度为26～28℃[37]。

菲牛蛭繁殖能力与体重和年龄有关，体重在5～15 g范围内时，菲牛蛭性腺系数随体重的增长而增长，当菲牛蛭体重10～15 g时，性腺系数最高，达3.129%，且产茧数以及孵化率最高；当菲牛蛭2～3年龄时，产茧数以及孵化率最高[39]。

4 菲牛蛭的人工养殖模式

菲牛蛭的养殖模式多种多样。菲牛蛭的人工养殖方式按照养殖环境不同可以分室内养殖和室外养殖，可以看作一级养殖模式；这两大类一级养殖模式又可以和土池塘、水泥池、垄沟、水泥池+土池塘等组合形成对应二级养殖模式，在此基础上，使用网箱、养殖箱组合形成三级养殖模式，从而组成单一或复合的养殖模式。

在现阶段我国人工养殖模式中，水泥池养殖模式占比为30%左右，多数为室外池塘+水泥池养殖[40]。周维官等[41]在养殖试验的过程中发现，菲牛蛭在经过10个月室内水泥池养殖模式后，条均净增重、成活率为0.919 g和67.3%，成活率与体增重较低。

室外土池塘（无网箱）养殖成本较低，建设在水源充足、环境安静、无污染、避风向阳的地方，同室外水泥池一致，当气温过高时，使用遮阳网避光降温，当气温过低时，建设大棚保温。周维官等[41]在养殖试验的过程中发现，菲牛蛭在经过10个月室内土池塘养殖模式后，条均净增重、成活率为1.087 g和79.3%，高于室内水泥池养殖模式。但由于养殖在室外土池塘中的水蛭容易逃跑与被天敌捕食，养殖过程中容易被气候影响，使用室外土池塘养殖水蛭的人较少，在现阶段我国人工养殖模式中，室外土池塘（无网箱）养殖模式占比约为3%左右[40]。

室外土池塘网箱养殖是基于室外土池塘养殖模式形成的，室外土池塘网箱养殖一定程度上避免了水蛭被天敌捕食与逃跑，但受气候影响较大，据调查现阶段我国人工养殖模式中，室外土池塘网箱养殖模式占比在45%以上[40]。

室外垄沟养殖（无网箱）是在室外土池塘养殖的基础上改良进行的，垄沟适量种植水草，垄沟应设有出入水口，防洪、泄洪沟，还有防逃逸装置[38]。周维官等[41]研究发现，室外垄沟养殖条均净增重、成活率为1.253 g和91.7%，养殖优势上室外垄沟养殖（无网箱）>室外土池塘养殖（无网箱）>室内水泥池养（无网箱）。室外垄沟养殖的淤泥量、土壤量和水草量均高于室外池塘养殖，且周维官在试验过程中发现，菲牛蛭在湿润土壤上的时间与在水体中的时间比约为7∶3，一定程度上说明室外垄沟养殖的环境更加符合菲牛蛭的生存习性。

除了以上4种养殖模式以外，还有其他一些较为不常见的养殖模式，例如：生态养殖、泡沫箱养殖、湿土养殖和集约化立体养殖模式等。生态养殖是在池塘养殖上加入其他经济作物同时养殖，比如莲藕，棱角等经济作物[42]。泡沫箱养殖，是在规格40 cm×60 cm×30 cm，箱内总底面积为5 m2的泡沫箱里进行菲牛蛭养殖[43]。湿土养殖模式是利用湿润的砂土壤代替水体，养殖密度达3 000尾/m2，可在此基础上进行立体养殖[44]。

5 菲牛蛭的养殖环境

菲牛蛭养殖水体应符合《渔业水质标准》（GB 11607），且水体pH应为5.5～7.0，为弱酸性[38]。在广州地区菲牛蛭生活水体有较高的HCO3-、Ca2+、SO42-，有较稳定的Ca2+，pH表现为中性偏酸[45]。菲牛蛭幼蛭最适生长水温范围为26～30℃，此时幼体各项生长指标达到高峰；菲牛蛭生长温度为18～34℃，当气温低于7℃，水温低于6.5℃时，菲牛蛭全部不活动，当气温21℃，水温19℃时活动最活跃[46]。

菲牛蛭养殖水体中可以添加一定量有益微生物，例如硝化细菌、光合细菌等有益微生物，有益菌能够显著的净化水体，增加水中氧气的溶解度，降低氨氮、亚硝态氮等物质[47]。菲牛蛭养殖水体溶解氧应大于4 mg/L，且菲牛蛭水体耗氧率随水温的升高而升高，当水温为20.2℃时，菲牛蛭幼蛭和成蛭的耗氧率分别为0.351、0.063 mg/(g/h)，30.4℃时，分别为0.624、0.110 mg/(g/h)[39，48]。菲牛蛭规范化养殖的养殖池土质应符合《土壤环境质量标准》（GB 15618）二级土壤的要求。含铁较高的土壤更有利于菲牛蛭的生长、繁殖；菲牛蛭规范化养殖的养殖场地应选择坐北向南，冬暖夏凉，环境安静、水源充足、进排水方便的地方兴建，并符合《水产品产地环境要求》（GB/T 18407.4）中“3.1”和“3.3”的规定要求[38]。

6 菲牛蛭的饲养管理

菲牛蛭幼蛭的喂食周期与其特定增长率呈现负相关关系，随着喂食周期的减短，幼蛭的各项生长指标均呈现上升趋势，从生长率考虑，建议菲牛蛭幼蛭喂食周期为2 d，养殖密度为75尾/L，从个体体质量增长率以及成活率综合考虑后，建议菲牛蛭成蛭喂食周期为10 d，养殖密度为8～10尾/L；建议菲牛蛭在6：00～10：00，17：00～19：00进行投喂[45，48]。

菲牛蛭高密度人工养殖，食物残渣极易污染水体，诱发菲牛蛭疾病，所以菲牛蛭饲喂时应当把饲料灌注到猪小肠或者人工肠衣当中，加入饲料之前，应当把饲料加温，加入后进行分段，并扎紧，每段长度约20～50 cm；喂食时间大约是0.5～1 h，菲牛蛭饱食之后会自动从肠衣上脱落，饲喂完成后应当及时收集剩料以及肠衣，防止水体污染[38]。

菲牛蛭致病原为“嗜水气单胞菌”与“奇异变形菌”，这两种病原菌可单独或共同引发菲牛蛭疾病，当发病时，菲牛蛭患病皮肤角质层脱落、溃烂、肌肉发生溃疡，腐烂，肌纤维溶解坏死，发出腐臭气味，身体肿胀，唾液腺排列混乱，部分断裂；病原菌对庆大霉素、新霉素等药物敏感，用板蓝根以及陈皮药浴治疗效果良好[49]。在对水体进行消毒时，硫酸铜、硫酸亚铁、高锰酸钾对菲牛蛭毒性较强，不建议作为水体消毒剂，而强氯精、二氧化氯对菲牛蛭的毒性较弱，可以作为水体消毒剂，生石灰会提升水体的pH，不符合菲牛蛭弱酸性生活环境的要求，而且难于控制使用量，不建议使用[50-51]。

7 菲牛蛭的人工饲料

菲牛蛭作为一种吸血蛭类，主要以脊椎动物的血液为食物，由于存在动物血液的生物安全性难以控制、饲喂时对环境的污染较大、饲料质量难以控制等问题，这使菲牛蛭的人工饲料研究成为人工养殖中的重点研究问题。

7.1 人工饲料与动物血液

菲牛蛭人工饲料与天然血液有一定差距，人工饲料饲喂的菲牛蛭生长率以及增重率低于脊椎动物血液，但成活率较高，菲牛蛭肠道抗氧化能力强。李军等[52-53]用血浆蛋白粉、血球蛋白粉等原料配制饲料，验证结果表明，饲料试验组成活率达100%，高于对照组（猪血）75%的成活率，个体体质量增长率达19.91%，低于对照组（猪血）（184.24%）。王雪等[54]以血球蛋白粉与血浆蛋白粉作为主要饲料原料，通过37 d的饲养，对比以鸡血饲喂的对照组后发现，人工饲料组特定生长率和增重率均低于鸡血饲喂组。熊伟等[55-56]以血球蛋白粉与血浆蛋白粉作为主要饲料原料，按照一定比例配制菲牛蛭人工饲料，通过60 d的饲养后发现，人工饲料投喂菲牛蛭，水蛭素活性未受影响，抗氧化指标方面，对菲牛蛭肠道抗氧化能力有一定的增强作用，人工饲料饲喂后菲牛蛭肠道丙二醛（MDA）含量等于或大于鸡血饲养含量；非特异性免疫方面，菲牛蛭酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（AKP）活性能达到或超过血液饲养水平，同时可以降低菲牛蛭溶菌酶（LSZ）的活性。

7.2 人工饲料与饲料原料

菲牛蛭人工饲料在选用上常以血球蛋白粉、血浆蛋白粉作为常用原料，血浆蛋白粉的饲喂效果优于血球蛋白粉，且有研究者认为从氨基酸组成来看，牛肉粉、大豆浓缩蛋白、猪肉粉、鸡肉粉等也可以作为菲牛蛭的饲料优选原料。李军等[52-53]以血球蛋白粉为主要原料，配比出一种菲牛蛭人工饲料，饲养后菲牛蛭成活率及体增重较差，将血球蛋白粉替换为血浆蛋白粉对饲料进行改良，验证结果表明，改良后饲料菲牛蛭成活率及体增重较好，血浆蛋白粉饲喂效果优于血球蛋白粉。

7.3 人工饲料与氨基酸添加

在菲牛蛭人工饲料中添加一定量的赖氨酸可以提升菲牛蛭生长率、增重率和水蛭素活性，促进了菲牛蛭的抗氧化能力和免疫功能。王雪等[54]以血球蛋白粉与血浆蛋白粉作为主要饲料原料，向人工饲料中添加赖氨酸，通过37 d的饲养后发现，当添加赖氨酸浓度为1.4 g/kg时，菲牛蛭的特定生长率、增重率和水蛭素活性最高，且对比以鸡血饲喂的对照组后发现，人工饲料组特定生长率和增重率均低于鸡血饲喂组。熊伟等[55]在研究添加一定赖氨酸到水蛭人工饲料时发现，赖氨酸的添加不仅提高了水蛭素活性和诱导水蛭素基因的表达，而且促进了菲牛蛭的抗氧化能力和免疫功能。且发现，适宜的赖氨酸添加浓度为1.4 g/kg，与王雪的实验结果一致。杨秀娟等[57]对蛋白饲料与菲牛蛭蛭体氨基酸组成进行灰色关联度分析，发现血浆蛋白粉与菲牛蛭蛭体的氨基酸灰色关联度为0.84，血粉、血球蛋白粉分别为0.73与0.69，血浆蛋白粉的氨基酸灰色关联度均高于血粉、血球蛋白粉，这和李军的研究结果一致，血浆蛋白粉作为原料，优于血球蛋白粉。

在人工饲料中添加L-精氨酸和氯化钠对吸血水蛭具有良好的诱食作用、K+具有毒性，许多菲牛蛭饲料中，均添加了L-精氨酸和氯化钠，作为菲牛蛭的诱食剂。Elliott[58]研究表明，添加L-精氨酸和氯化钠（或者氯化锂）对欧洲医蛭具有诱食的效果。Kornreich等[59]研究水蛭的味觉感受器时发现，精氨酸对吸血蛭类具有诱食作用，而Cl-离子具有维持水蛭的连续摄食作用，而K+对北美巨蛭具有毒性；苦味物质（苯甲地那铵、奎宁）能终止水蛭的摄食行为；水蛭的味觉感受器位于肠道内的背唇组织。因此在制作菲牛蛭人工饲料时，应当保证Cl-含量、可以使用精氨酸作为诱食剂，避免K+过度添加。

8 小结

菲牛蛭作为一种药用价值高、饲养经济价值佳的药用动物，其应用的领域正在不断被拓展。由于天然水蛭素在药效上、安全性上比重组水蛭素更好，现阶段天然水蛭素只能从活体水蛭中获取，这使水蛭养殖的研究在水蛭研究领域成为重点。同时，菲牛蛭作为一种药用动物，具有抗凝血、抗肿瘤、抗炎、降血脂多种功效，含有水蛭素、菲牛蛭素等多种活性成分，其主要抗凝血功能在单位质量上均优于其他几种水蛭，且在经济效益上优于其他水蛭，使菲牛蛭成为了水蛭研究中的重点研究对象。对于菲牛蛭的研究，在养殖环境、人工饲料、饲养管理、品种繁育、养殖模式等方面，仍有很大的研究前景和空缺，需要进一步加强养殖环境研究，人工饲料研究、以及养殖模式等养殖技术的研究，建立系统化的养殖技术。