帕金森病大鼠模型制作方法研究进展

陈子方，吴海妹，沈凡艺，谭慧，郭沛鑫，解宇环

云南中医药大学，昆明650500

帕金森病（PD）是一种多发于中老年的、最常见的神经退行性病变之一。PD 病因及机制极其复杂，目前多巴胺（DA）神经元变性坏死所导致的多巴胺分泌严重不足被认为是主要发病原因。PD 患者常可见神经元内α-突触核蛋白（α-SYN）及路易小体的积聚。PD 的发病机制、新型治疗方案及药物等一直是该领域研究热点，上述研究也推动了契合临床的PD 模型研究。PD 的灵长类动物模型能较好模拟临床症状，但花费较多，不利于前期的药物筛选和实验研究；而某些啮齿类小动物如小鼠等由于其脑部体积较小，不易区分相关脑区，手术操作难度较大，针对特定脑区的研究存在局限性。PD 大鼠模型制作经济实惠且能较好模拟临床病变。本课题组前期研究也发现，在某些PD 模型如6-羟基多巴胺（6-OH⁃DA）所致的PD 模型复制过程中，大鼠的存活率和造模成功率明显高于小鼠，且操作更为简便。目前常用PD大鼠模型主要有有神经毒素诱导模型、脂多糖诱导模型、转基因模型、基因敲除模型、蛋白酶体抑制剂诱导模型、乙型脑炎病毒所致模型等［1］。现就常用PD大鼠模型制作方法相关研究进展进行综述。

1 神经毒素诱导的PD模型

1.1 6-OHDA 诱导的PD 模型 6-OHDA 可以引起线粒体融合蛋白的改变，干扰线粒体持续的融合、分裂和运动，干扰ATP 合成，最终导致DA 神经元死亡。6-OHDA 不能穿过血脑屏障，造模时需采用脑立体定位仪将6-OHDA 注射于特定脑区。有文献报道，采用单侧两点法造模成功率高于一点法，其具体方法为：将麻醉后的大鼠固定于脑立体定位仪上，以0.2% 6-OHDA（溶于0.02% 抗坏血酸溶液，防止6-OHDA 氧化）注射到右侧的黑质致密部位（SN），两个注射点相对于前囟的内侧、硬脑膜腹侧的表面坐标如下：坐标1 为前囟后（PB）3.0 mm，中位右侧（MRL）2.5 mm，腹侧硬脑膜下（VD）8.6 mm；坐标2为PB 2.4 mm，MRL 2.7 mm，VD 8.6 mm。在注射6-OHDA 2 周后注射0.01% 阿朴吗啡10 mL/kg 诱导大鼠旋转行为，转速超过7圈/min（Φ 35cm/轮）判定为造模成功［2］。

有研究发现，6-OHDA 可产生不稳定抑郁症状［3］，向Wistar 大鼠脑内定向注射6-OHDA，术后2周表现为蔗糖偏好增强，术后3 周出现明显的抑郁症状，因此6-OHDA 可用于制作PD 伴急、慢性抑郁（PDD）模型。KAMINSKA 等［4］认为在大鼠内侧前脑束注入高剂量6-OHDA（16 µg/4 µL）可诱发神经和行为学改变，较适用于建立晚期PDD 模型。邢红霞等［5］在6-OHDA 所致PD 模型的基础上，通过给予大鼠急性强迫游泳，制作PD 伴急性抑郁模型；通过慢性不可预见性的温和应激制作PD伴慢性抑郁模型。研究发现，上述两组模型无论动物行为学还是单胺类神经递质变化都与PD模型差异不大，推测PDD的成模机制可能以内源性因素6-OHDA起主导作用。

1.2 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）诱导的PD 模型 MPTP 因其脂溶性可快速通过血脑屏障，其毒性机制与其在脑内生成活性物质甲基苯基吡啶离子（MPP+）、抑制线粒体复合物Ⅰ的活性并导致DA 神经元变性及凋亡有关。曾朝蓉等［6］对雄性SD 大鼠腹腔注射MPTP（30 mg/kg，7 d），结果显示，大鼠运动功能减退，直接胆红素水平降低，血红蛋白、红细胞、白细胞、中性粒细胞升高，中脑黑质出现病理变化。

1.3 鱼藤酮诱导的PD模型 鱼藤酮是线粒体复合物Ⅰ抑制剂，脂溶性高，易通过血脑屏障，且无需转运即可进入DA 神经元。其毒性机制包括增强氧化应激、诱导α-SYN 积聚致使DJ-1 和Parkin 突变，导致线粒体和蛋白酶体功能障碍，最终引起DA 神经元凋亡。鱼藤酮模型增强了DA 通路中的氧化应激和神经炎症，能涵盖PD 的大部分病理特征［7］。注射鱼藤酮诱导大鼠PD模型的方式可分为皮下注射、腹腔注射、静脉注射和纹状体定位注射。

1.3.1 皮下注射 有文献报道，在SD 大鼠颈后皮下注射鱼藤酮（2 mg/kg，4 周），大鼠运动缓慢、次数减少，伴震颤、不稳定的步态，黑质致密部有明显的α-SYN 积聚［8-9］；鱼藤酮注射量在2 mg/kg 以上，大鼠体质量出现明显下降，酪氨酸羟化酶（TH）免疫反应神经元数量显著减少，且皮下注射2 mg/kg 鱼藤酮有利于α-SYN形成。

1.3.2 腹腔注射 实验表明，对大鼠连续腹腔注射鱼藤酮（2 mg/kg、4周，或1.5 mg/kg、2月，或2.5 mg/kg、2 月），大鼠体质量减轻，纹状体和前额叶皮层分泌的DA 减少，纹状体TH 的免疫反应活性降低［10］。但也有学者［11］发现，对大鼠腹腔注射2 mg/（kg·d）的鱼藤酮、5 d/周、连续6周，没有导致大鼠运动障碍或黑质纹状体DA 神经元病变，反而引起了以胃肠功能障碍为表现的非运动症状。

1.3.3 静脉注射 对大鼠静脉注射相对高剂量鱼藤酮（10～18 mg/kg，7～9 d），大鼠出现运动障碍、纹状体和苍白球损伤；注射相对低剂量鱼藤酮（2 mg/kg或2.5 mg/kg或3 mg/kg，21 d），大鼠出现运动迟缓，其中2 mg/kg 组并未显示TH 免疫活性降低，但随着鱼藤酮剂量增加，24% 的大鼠出现TH 免疫活性降低［12］。静脉注射操作简便、药效迅速，但也容易增加大鼠因脏器系统毒性死亡的概率。

1.3.4 纹状体注射 有研究者将鱼藤酮溶解在DMSO、聚氧乙烯蓖麻油和生理盐水的混合溶剂中，以三点分别定向注射4 µg/2 µL 的鱼藤酮溶液到雄性SD大鼠右侧纹状体，发现该模型使大鼠纹状体和黑质中TH 免疫活性降低，且能保持大鼠100% 的存活率［13］。

2 脂多糖（LPS）诱导的PD模型

LPS 是革兰阴性菌细胞壁的主要成分，是重要的内毒素。LPS 不能透过血脑屏障，通过脑内定位注射而诱导的神经炎症可以复制PD的部分特征，包括小胶质细胞过度激活引起的机体炎症反应及黑质纹状体系统DA神经元的选择性损伤。

2.1 黑质内注射 黑质区域定位注射LPS 可特异性地激活黑质区域的小胶质细胞，排除因其他神经退行性疾病所致小胶质细胞激活带来的干扰［14］。HERRERA 等［15］通过立体定位注射2.0 µL 的LPS 至Wistar 雄性大鼠的黑质，发现大鼠TH 免疫活性降低，DA神经元受损，且损害不可逆。

2.2 注射至苍白球 实验证明，将LPS（10 µg/4 µL）注射到大鼠苍白球两坐标，大鼠出现黑质纹状体系统中TH 阳性神经元减少、小胶质细胞持续激活、黑质中α-SYN 积聚增强等病理变化，其变化程度随着大鼠年龄的增长更显著，侧面论证了老龄化是PD诱因之一的观点［16-17］。

2.3 纹状体内注射 有学者将LPS 分4 个坐标（3µL/坐标）注射到雄性SD 大鼠右侧纹状体，实验结果显示，大鼠黑质内DA 神经元减少，神经元内α-SYN和泛素蛋白积聚，大鼠出现行为学障碍［18］。

2.4 脑室内注射 李军泉等［19］在雄性SD大鼠前囟后0.8 mm、旁开1.3 mm、硬膜下3.5 mm 处，立体定位分别向脑室内注射LPS 10、25、50 µg，发现脑室内炎症反应促使黑质部位小胶质细胞被广泛激活，且至24 周仍呈现 不同程 度 的激活。ZHOU 等［20］将25 µg LPS 立体定向注射到SD 大鼠右侧脑室，结果表明，LPS 注射到侧脑室内相较于注射到黑质致密部位（SN）或纹状体内局部区域，能更好地模拟PD的进行性病变过程。

3 转基因PD模型和基因敲除PD模型

PD 以散发性为主，约10%～15% 呈家族性。PD遗传基因相关研究显示，至少有20个位点和15个致病基因与家族性和散发性PD相关［21］。提示PD存在潜在的基因治疗靶点。随着哺乳动物基因组工程和技术的发展以及病毒表达载体的优化，能够运用的PD 转基因大鼠模型和基因敲除大鼠模型也逐渐增多。虽然使大鼠诱发基因突变的难度大于小鼠，且无法完全复制人类疾病的各种特征，但大鼠模型能更好地再现PD 的典型特征，包括黑质DA 神经元的进行性损害、局部运动行为缺陷和年龄依赖性的α-SYN异常积聚，其中以α-SYN异常积聚最为明显［22］。因此，转基因或基因敲除大鼠模型可能有更大的研究价值。

3.1 转基因PD模型

3.1.1 LRRK2转基因模型 LRRK2是位于细胞膜上的多结构域蛋白。携带LRRK2 基因突变者发展为PD的可能性随着年龄的增长而增高。尸检发现，大多数LRRK2 突变的PD 患者脑内有α-SYN 包涵体，表明LRRK2与α-SYN 所致PD 发病有共同机制。有研究将不同量的纯化LRRK2p.G2019S 稀释于微量注射缓冲液后注入SD大鼠受精卵的原核中，培育出的雄性BACLRRK2 p.G2019S 大鼠出生后3、6、12月运动能力逐渐降低，但12 月龄时纹状体DA 功能无异常，TH 表达也无明显变化，推测LRRK2 突变可能是PD发病原因的一部分，可能需要其他基因或环境共同作用，包括神经变性、DA 分泌减少在内的PD典型特征可能发生在晚期［23］。研究者认为，虽然上述LRRK2p.G2019S 大鼠没有成为典型的PD 模型，但它们仍然是研究LRRK2 相关神经生物学病变的有用资源［24］。相反的，另有研究者把人LRRK2R1441G基因注入到SD 大鼠受精卵的原核中，大鼠出生后3、6、9、12 月均表现出PD 相关的运动缺陷；大鼠12月龄时给予腹腔注射百草枯2 次，至16 月龄才出现明显的运动缺陷，且没有表现出受百草枯影响的倾向，故研究者认为转基因LRRK2R1441GBAC 大鼠不是PD的可行模型［25］。

3.1.2 α-SYN 转基因模型 α-SYN 与PD 发病密切相关，α-SYN 通常以无结构状态存在于突触前膜，具有调节突触可塑性、整合突触前信号等功能。α-SYN 突变是常染色体显性遗传PD 的罕见形式，目前已发现3 种突变形式，包括A30P、A53T、E46K。突变的α-SYN 容易产生错误折叠，进而可引起细胞损伤。有学者［26］在Wistar大鼠黑质部位注射携带A53Tα-SYN 的重组腺相关病毒的载体溶液3 µL，21 d 后观察到大鼠出现明显运动障碍；28 d 后发现大鼠注射部位对侧（左）前爪使用率降低了50%；32 d后PET成像观察到多巴胺转运体结合率降低85%，免疫组化显示黑质中α-SYN 阳性聚集体形成。另有实验利用腺相关病毒作为载体，将α-SYN基因递送至雄性SD大鼠黑质区，13周后经皮下植入渗透性微型泵，并连续注入鱼藤酮4周，大鼠出现典型的PD 三联征（进行性运动功能障碍、黑质纹状体神经变性、α-SYN 积聚），且受损神经元对鱼藤酮更加敏感［27］。

3.2 基因敲除PD 模型 Parkin 是由PARK2 基因编码的一种蛋白，具有E3 泛素连接酶功能，参与泛素蛋白水解酶系统，有助于维持细胞正常生命活动，在PD的氧化应激、线粒体损伤及蛋白酶体功能紊乱中也起到重要作用［28］。PINK1基因是第一个定位在线粒体上与PD 相关的基因，PINK1蛋白定位于线粒体膜的Ser/Thr 激酶，参与线粒体运输、线粒体和蛋白酶体功能表达等过程，其正常表达可以减轻氧化应激对线粒体功能的损害和蛋白酶抑制剂所致的细胞凋亡。DJ-1 作为抗氧化剂和分子伴侣，在体内广泛表达，其突变与常染色体隐性遗传的早发PD 有关。DJ-1 可通过氧化应激使蛋白酶体降解系统紊乱，并能将胞质内蛋白移至线粒体，致使线粒体功能异常或降低。

DAVE 等［29］在4～5 周龄Long Evans Hooded 雌性大鼠体内注射20 U 的妊娠马血清促性腺激素，48 h后注射50 U 人绒毛膜促性腺激素，立即与雄性大鼠交配，1 d 后得到受精卵；将ZFN mRNA 以10 ng/µL注射到受精卵原核中，受精卵植入雌鼠体内，产生第一代杂合鼠；筛选带有所需基因的杂合鼠进行交配，最终得到纯合子的Parkin、Pink1、DJ-1 基因敲除大鼠。与野生型（WT）大鼠进行比较，Pink1 敲除大鼠和DJ-1敲除大鼠从4月龄开始表现出明显的运动缺陷，8 月龄时约50% 的DA 细胞丧失，出现黑质神经变性；而Parkin敲除大鼠没有显示出PD 相关病理表现。另外，Pink1 敲除大鼠和DJ-1 敲除大鼠不显示临床PD 表型的其他特征，脑区内无α-SYN 积聚，但仍能够导致大鼠多巴胺能神经元变性［30-31］。

此外，还有学者用蛋白酶体抑制剂或乙型脑炎病毒诱导出PD 模型。张克忠等［32］将蛋白酶体抑制剂Lac tacystin 以两点法立体定位注射到SD 雄性大鼠黑质部位，大鼠1周后出现运动障碍且逐步加重、TH 阳性细胞数明显减少、α-SYN 表达明显增加，该模型具有稳定、可重复、简便易操作的特点，是目前认为比较接近PD 实际情况的模型。HAMAUE 等［33］将提取的乙型脑炎病毒株JaGAr-01 稀释后加入MEM培养基内，并注入出生13 d的Fischer大鼠黑质区域，结果显示黑质内TH 阳性DA 神经元数目明显减少，大鼠出现运动迟缓症状，但该方法造模的可行性及稳定性有待进一步验证。总之，目前用于科学研究的PD模型均存在一定局限性，并不能完全契合临床的实际状况。因此，在实际研究过程中，可采用多种模型结合、共同评价的方式进行。尽早构建出稳定、高度契合临床的PD 模型，对PD 的发病机制、新型治疗方案及药物研究都至关重要。