药物难治性癫痫患儿的肠道菌群变化观察

赵金华，徐明，朱美君，孙晓娟

南通市第一人民医院儿科，江苏南通226001

癫痫是由不同病因引起的，脑部神经元高度同步化的异常放电所致，是一种慢性的、反复出现的发作性疾病。癫痫为患儿最常见的神经系统疾病，患病率在0.3%～0.9%［1］。大约三分之一的癫痫患儿最终发展为难治性癫痫［2］。尽管通过药物、饮食、手术、迷走神经刺激等方法，难治性癫痫仍然无法得到控制，而生酮饮食治疗难治性癫痫已取得确切疗效［3］。越来越多的研究表明，癫痫发病可能与脑肠轴失衡有关［4］。肠道微生物群通过肠—脑相互作用在广泛的神经障碍中发挥作用，但肠道菌群变化与难治性癫痫的关系目前少见报道。我们以健康患儿及药物治疗反应性癫痫患儿作为对照，观察了难治性癫痫患儿的肠道菌群变化，从而明确肠道菌群与难治性癫痫的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料选取2019年9月-2020年6月在南通市第一人民医院儿科就诊的初诊癫痫患儿50例（癫痫组），男35例、女15例，年龄1～10（4.97±2.30）岁。选同期在南通市第一人民医院儿保门诊体检健康的患儿25例作为对照组，其中男17例、女8例，年龄1～10（4.64±2.23）岁。入组癫痫患儿及健康患儿均获得监护人的知情同意。入组癫痫患儿根据癫痫药物治疗原则［5-6］进行抗癫痫治疗。根据抗癫痫治疗效果将患者分为药物难治组（抗癫痫治疗6个月癫痫发作减少≤50%）19例和药物反应组（癫痫发作减少＞50%）31例。药物难治组使用抗癫痫药物有丙戊酸钠（VPA）16例；奥卡西平（OXC）11例；左乙拉西坦（LEV）7例；托吡酯（TPM）5例；拉莫三嗪（LTG）4例；氯硝西泮（CZP）2例；氨己烯酸（VGB）1例。药物反应组使用抗癫痫药物有VPA 20例；OXC 11例；LEV 6例；TPM 3例。

1.2 肠道菌群的分析采用高通量测序分析方法。收集癫痫组患儿治疗前、治疗6个月后及对照组患儿的粪便标本，取粪便的中段样本，每份标本重量应大于5g，标本采集后立即冷冻，运送到高通量测序服务公司（南京金域医学检验所有限公司）。对粪便样本提取细菌总DNA，随后进行16 S靶向扩增、物种注释及丰度分析，并与现有的健康肠道菌群数据库进行比对，得到所有样本的菌群数据谱。

1.3 统计学方法采用SPSS17.0统计软件。计量资料以±s表示，两组比较用t检验，多组间比较采用方差分析、进一步组间比较采用LSD-t检验；计数资料以频数或百分率表示，比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药物反应组、药物难治组、对照组肠道菌群多样性分析结果癫痫组、对照组肠道菌群多样性分别为3.41±0.28、3.25±0.26，两组比较，t=2.408，P＜0.05。药物难治组、药物反应组肠道菌群多样性分 别 为3.55±0.24、3.33±0.27，两 组比 较，t=2.987，P＜0.05。

2.2 药物反应组、药物难治组、对照组门水平优势菌及差异组成分析结果药物难治组治疗前检出拟杆菌门及厚壁菌门分别为4、10例，F/B 2.50；治疗后检出B、F分别为8、7例，F/B 0.87。药物反应组治疗前检出B、F分别为15、11例，F/B 0.73；治疗后检出B、F分别为17、8例，F/B 0.47。对照组检出B、F分别为26、12例，F/B 0.46。门水平的优势菌群组成中，差B及F对照组、药物反应组治疗前后的优势菌群均为拟杆菌门；药物难治组治疗前的优势菌群为厚壁菌门，治疗后优势菌群为厚壁菌门和拟杆菌门。药物难治组治疗前的F/B值高于药物反应组和对照组（P＜0.05）。

2.3 药物反应组、药物难治组、对照组属水平优势菌及差异组成分析结果药物难治组治疗前前10位优势菌属分别为：梭菌属（Clostridium）、拟杆菌属（Bacteroides）、克罗诺杆菌（Cronobacter）、多枝梭菌（Erysipelatoclostridium）、瘤胃球菌属（Ruminococ‑cus）、普氏菌属（Prevotella）、粪杆菌属（Faecalibacte‑rium）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、劳特菌属（Blautia）、阿克曼菌（Akkermansia），占比分别为30.56 %、15.16%、9.56%、7.73%、5.13%、4.92%、4.83%、4.78%、1.32%、0.78%；治疗后前10位优势菌属菌群分别为拟杆菌属、梭菌属、双歧杆菌属、粪杆菌属、阿克曼菌、普氏菌属、瘤胃球菌属、克罗诺杆菌、狄氏副拟杆菌（Parabacteroides）、多枝梭菌，占比分别为34.12%、12.16%、9.97%、9.02%、6.92%、6.59%、4.71%、4.70%、1.42%、0.85%。药物反应组治疗前前10位优势菌属菌群分别为拟杆菌属、瘤胃球菌属、梭菌属、普氏菌属、双歧杆菌属、多枝梭菌、劳特氏菌属、粪杆菌属、克罗诺杆菌、狄氏副拟杆菌，占比分别为38.35%、11.28%、8.12%、7.72%、7.18%、4.78%、4.57%、3.28%、2.83%、1.02%；治疗后前10位优势菌属菌群分别为拟杆菌属、普氏菌属、瘤胃球菌属、双歧杆菌属、粪杆菌属、梭菌属、克罗诺杆菌、阿克曼菌、考拉杆菌属（Phascolarctobacte‑rium）、劳特氏菌属，占比分别为40.89%、11.67%、10.82%、8.34%、5.48%、3.02%、2.91%、2.19%、1.42%、0.98%。对照组菌群前10位优势菌属分别为拟杆菌属、粪杆菌属、双歧杆菌属、普氏菌属、克罗诺杆菌、瘤胃球菌属、劳特菌属、罗斯菌属（Rose‑buria）、狄氏副拟杆菌、梭菌属，占比分别为39.32%、12.38%、12.21%、7.15%、6.17%、3.12%、2.62%、1.76%、1.38%、1.15%。

药物反应组治疗前后优势菌群差异不大，优势菌群为拟杆菌属、瘤胃球菌属和普氏菌属（t=1.502、P＞0.05；t=1.383，P＞0.05、t=6.751，P＜0.05）。药物难治组治疗前后优势菌群差异较大，治疗后丰度增加的菌属有拟杆菌属、双歧杆菌属及阿克曼菌（t分别为58.587、8.179、16.463，P均＜0.05），减少的有梭菌属、克罗诺杆菌及多枝梭菌（t分别为22.635、10.999、21.827，P均＜0.05）。

治疗前，与对照组、药物反应组比较，药物难治组丰度多的菌属有梭菌属（F=1359.239，P＜0.05；两两组间比较，t分别为52.08、36.76、14.55，P均＜0.05）和克罗诺杆菌（F=118.411，P＜0.05；两两组间比较，t分别为8.26、15.17、9.60，P均＜0.05），丰度少的菌属有拟杆菌属（F=479.032，P＜0.05；两两组间比较，t分别为29.70、26.37、1.41，药物反应组与对照组间比较，P＞0.05，余两两组间比较，P均＜0.05）和双歧杆菌属（F=99.262，P＜0.05；两两组间比较，t分别为12.64、3.79、10.09，P均＜0.05）。治疗后，与对照组、药物反应组比较，药物难治组治疗前原有丰度多的菌属如梭菌属仍有差异（F=579.246，P＜0.05；两两组间比较，t分别为33.74、25.91、6.76，P均＜0.05），原有丰度少的菌属如拟杆菌属（F=12.723，P＜0.05；两两组间比较，t分别为4.53、5.45、1.61，药物反应组与对照组间比较，P＞0.05，余两组间比较，P均＜0.05）和双歧杆菌属（F=27.557，P＜0.05；两两 组间 比较，t分别 为3.61、2.43、7.35，P均＜0.05）亦仍有差异。

3 讨论

肠道菌群作为一大类微生物群主要定植于人体消化道中，数目多、类别丰富，与宿主的免疫系统发生一系列动态相互作用，有助于维持代谢动态平衡，维生素B的合成，改善消化，促进血管生成和神经功能［7-8］。人体肠道定植约104数量级的细菌丛，其细胞总数大约是人体自身细胞的10倍，根据细菌16 S rRNA序列分类，肠道细菌有500～1 000种，主要由厚壁菌门（如Ruminococcus，Clostridium，Eubacte‑ria）、拟杆菌门（如Porphyromonas，Prevotella）、放线菌门（如Bifidobacterium）等组成［8-9］。本研究亦证实不管是正常健康患儿还是癫痫患儿，其肠道菌群均主要由厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、变形菌门等组成，只不过优势菌群各有不同。

“肠脑轴”是指胃肠和中枢神经系统之间的双向相互作用。较多研究表明，神经系统疾病与脑肠轴失衡有关［4］，大脑可能通过免疫系统、神经系统、内分泌系统调控胃肠道功能，而肠道菌群可能通过迷走神经、神经递质（如5-羟色胺、多巴胺）、神经营养因子（如脑源性神经营养因子）等影响大脑功能。既往研究发现，肠道菌群和大脑之间有五种可能的交流途径，其中包括神经连接、下丘脑—垂体—肾上腺轴、肠道细菌合成的神经递质、肠道免疫系统以及肠黏膜屏障与血脑屏障之间的相互连接［10］。药物难治性癫痫患者约占全球癫痫患者总数的三分之一，其耐药性的病理生理机制尚未完全阐明；然而，目前的证据表明，肠道生态失调可能是致病因素之一［11］。本研究发现，与健康患儿及药物反应性癫痫患儿相比，药物难治性癫痫患儿的肠道菌群多样性显著增高，稀有微生物群的丰度增加，与PENG等［12］研究结果一致。但XIE等［13］研究发现药物难治性癫痫患儿的肠道菌群多样性是下降的；LINDEFELDT等［14］研究显示药物难治性癫痫患儿的肠道菌群多样性没有显著差异，与本研究结果不一致。笔者分析三个研究结果不一致的原因考虑与研究对象年龄差异有关，因为肠道微生物组成在很大程度上显示出年龄依赖性［10］，故药物难治性癫痫患儿的肠道菌群的多样性变化尚需进行大样本的研究。既往多数研究［12-14］均提示药物难治性癫痫患儿的厚壁菌门增多，拟杆菌门下降，F/B显著升高。本研究结果显示，与健康患儿及药物反应性癫痫患儿相比，药物难治性癫痫患儿的肠道菌群F/B升高，与文献报道相似。F/B是衡量整个肠道微生物平衡的重要指标，药物难治性癫痫患儿的肠道菌群F/B显著升高提示其肠道微生物失衡。

药物反应组癫痫患儿抗癫痫治疗前后肠道优势菌门差异不大，优势菌群以拟杆菌门为主，与健康患儿相仿。药物难治组癫痫患儿抗癫痫治疗前后肠道优势菌门差异较大，治疗前以厚壁菌门占优势，治疗后变为厚壁菌门与拟杆菌门均占优势。药物难治组与对照组、药物反应组治疗前肠道菌群的菌属比较，丰度多的菌属有梭菌属和克罗诺杆菌，丰度少的菌属有拟杆菌属和双歧杆菌属。梭菌属能够通过发酵糖和蛋白产生有机酸和醇类，属内多个菌种可以产生毒素，含量过高可引发炎症，而炎症参与癫痫发展，炎症和癫痫之间的因果关系是相互的［15-18］。双歧杆菌丰度减少的一个结果可能是短链脂肪酸的产生减少，特别是乙酸盐和丁酸盐。丁酸盐能保护原代神经元和神经母细胞瘤细胞免受氧化损伤。乙酸和丁酸是短链脂肪酸的组成部分，短链脂肪酸是肠道阴离子的主要存在形式，能被肠上皮细胞迅速吸收。短链脂肪酸对哺乳动物产生多种有益作用，如免疫调节和能量消耗，短链脂肪酸也可能有助于调节大脑中小胶质细胞的成熟和功能。由于短链脂肪酸的神经活性及其对其他肠脑信号通路的影响，短链脂肪酸可能直接或间接地通过微生物群—肠—脑轴参与交流。LEE等［19］发现，双歧杆菌群可作为癫痫相关肠道微生物组的潜在生物标志物之一。因此，双歧杆菌属可能可作为判断癫痫治疗效果的潜在生物标志物，其减少不利于癫痫的治疗，提示在抗癫痫的治疗中补充双歧杆菌属是有益的。

综上所述，药物难治性癫痫患儿存在肠道菌群失调，肠道菌群多样性及稀有性细菌增多。肠道菌群与癫痫存在关联，我们有可能通过改变肠道微生物群，从而治疗癫痫［20］。由于药物反应性和难治性癫痫患者的肠道菌群组成存在显著差异，肠道微生物的差异可能用以预测癫痫患者的预后和评估药物治疗反应。但目前仍缺乏抗癫痫药物与肠道微生物群直接相互作用的证据。一项体外研究显示，拉莫三嗪可抑制大肠杆菌中核糖体的产生［21］，一项动物研究表明，氯硝西平可被肠道菌群代谢［22］，未来需要对抗癫痫药物与肠道微生物群相互作用的影响进行更深入的研究。