外泌体分离、表征方法及其在环境毒理学中的应用研究进展

董平轩，崔淑芹，杨朝，尹文英，朱俊宇，童明琼

德州学院医药与护理学院，山东德州253023

1983年，JOHNSTONE等［1］在绵羊网织红细胞上清液中首次发现囊泡状结构，并将其命名为exosome，即外泌体［2］。外泌体是一类由细胞分泌的直径30～150 nm脂质双分子层囊泡，膜内含有蛋白质、脂类、mRNA、miRNA和代谢物等［3］。外泌体密度介于1.13～1.21 g/cm³，最早形成于细胞胞吞形成的早期内体，早期内体再内凹形成管腔内囊泡，管腔内囊泡进一步形成多泡小体，多泡小体与细胞膜融合被分泌出去，形成外泌体［3-4］。几乎所有细胞都能产生外泌体，外泌体可从各种体液和肿瘤等实体组织中分离出来［4］。研究［4］显示，外泌体参与免疫反应、病毒感染、心脑血管疾病和癌症等生理病理过程。VALADI等［5］发现，鼠肥大细胞分泌外泌体将其携带的mRNA传递给人肥大细胞，并翻译成蛋白质。外泌体还通过其携带的mi RNA调节靶细胞mRNA水平。研究［6］发现，外泌体通过其携带的调节神经回路发育信号分子，使受疾病影响的脑细胞恢复正常。近期研究［7］显示，来自新冠病毒肺炎（COVID-19）重症患者肺细胞外泌体参与了病毒侵染和免疫逃逸过程。外泌体成分反映了供体细胞的状态，因此分析外泌体可实现对癌症等疾病的早期诊断［4］。外泌体还因其毒性低、无免疫原性和渗透力好等优势，在miRNA、抗体和化疗药物等药物递送中具有巨大应用潜力［4］。在环境污染物的毒性和机理研究中，外泌体及其内含物也被作为生物标志物或用于阐释致病机理的模型。因此，需要开发简单、快速、高通量且不破坏外泌体结构的分离方法和更准确的表征方法，有利于其后期功能研究和应用。本研究就外泌体分离和表征方法及其在环境毒理学中的应用进展进行了综述，以期为探索外泌体环境污染物毒性及其毒性机制研究领域的潜在应用提供思路。

1 外泌体的分离方法

依据外泌体密度、大小和所含标志蛋白等特性，产生了不同的外泌体分离方法，包括超速离心法、聚合物沉淀法、免疫捕获法、尺寸排阻色谱法、超滤法和微流控技术法等［8］。外泌体的分离存在许多难点，一是外泌体来源的异质性和复杂性；二是方法的可扩展性和通量，如临床治疗用的外泌体需要符合GMP标准的大规模外泌体的提取方法［9］；三是样品收集、处理和保存的指导原则/标准的建立，以保障研究的可重复性和临床应用［8］。开发回收率高、高特异性和高通量的分离方法是外泌体分离的未来发展趋势。

1.1 超速离心法 超速离心又称为差速离心，是一种基于外泌体的密度和尺寸的分离方法，最高离心力通常选择100 000～120 000×g。JOHNSTONE早期分离外泌体也是采用此法。THERY等［9］对从细胞上清、尿液、血清及腹水等体液中差速离心分离外泌体进行了总结。先经300×g、2 000×g、10 000×g低速和高速离心去除细胞、死细胞和细胞碎片，再经4℃超高速100 000～120 000×g离心，获得沉淀，PBS重悬后，再次超高速100 000×g离心沉降外泌体以去除杂蛋白。此方法比较成熟，处理较大容量的样本，应用范围广，因此成为使用频率最高的一种分离方法［11］。但也存在外泌体纯度不高，需要投入昂贵的设备等缺点。超速离心得到的样品可通过密度梯度离心提高分离外泌体的纯度［12］。密度梯度离心的介质主要是蔗糖、碘海醇和碘克沙醇等［10］。密度梯度离心法操作复杂，对操作者技术要求较高、通量不高、耗时较长，且不易去除血液样本的脂蛋白和乳糜微粒［8］。

1.2 聚合物沉淀法 聚合物沉淀法依据聚合物降低外泌体的溶解性易于沉淀来纯化外泌体，可以提取血液、脑髓液、尿液、细胞培养上清等样本的外泌体，通常使用聚乙二醇（PEG）。许多商品化试剂盒是基于聚合物沉淀原理分离外泌体。用Invitrogen、101Bin和Wako等试剂盒和传统的超速离心法提取外泌体，结果显示不同试剂盒分离外泌体的产率不同［13］。郑程峰等［14］用试剂盒分离人牙髓细胞外泌体的产率比差速离心法高，但含有杂质。聚合物沉淀法有简单、快速且无需使用昂贵设备等优点。但商品化试剂盒价格昂贵，纯化过程中易受到聚合物污染影响后续实验［8］。

1.3 免疫捕获法 CD63、CD9、CD81和ALIX等外泌体表面的膜蛋白可与相应抗体产生特异性免疫结合反应，实现外泌体的提取。商业化试剂盒（Exo-Flow）基于此分离外泌体［8］。NAKAI等［15］利用小鼠T淋巴细胞膜蛋白（Tim4）和外泌体表面磷脂酰丝氨酸的特异性结合分离纯化外泌体。免疫捕获法有特异性强、能有效减少蛋白质等干扰物的优点，缺点是抗体成本高，通量小等。SAMSONOV等［16］利用凝集素对外泌体膜上糖类残基高亲和力的特性，从尿液中分离出了外泌体。根据肝素非特异性结合多种蛋白的性质，BALAJ等［17］从细胞培养上清和人血浆中提取出了外泌体。这在一定程度上降低了费用，但含有较多杂质。

1.4 尺寸排斥色谱法 尺寸排斥色谱又称空间排阻色谱，是根据分子或颗粒物的尺寸大小进行外泌体分离的一种方法。AN等［18］使用尺寸排斥色谱、超速离心法、先超速离心后用尺寸排斥色谱三种方法分离人血清外泌体，结果显示，尺寸排斥色谱提取的外泌体蛋白和血清蛋白含量更高，先超速离心后用尺寸排斥色谱提取外泌体可去除血清蛋白。尺寸排斥色谱的优势是操作简单、重现性好，处理样本量大且分离的外泌体大小比较均匀［19］，其缺点是处理样本时会稀释其浓度，色谱柱不能重复使用，且费用较高。

1.5 超滤法 不同孔径（0.22μm、0.45μm和0.8μm）超滤膜可以分离不同大小的胞外囊泡和外泌体。超滤法可结合差速离心分离外泌体，样品先经0.45μm滤膜去除细胞和细胞碎片，低温超速离心获取沉淀，PBS重悬后再次离心，再经0.22μm滤膜除菌得到高纯度外泌体。超滤法提取外泌体具有简单、快速和高效的特点，缺点是膜的粘附性降低外泌体的产量，过滤时压力和剪切力会使外泌体变形受损，且滤膜容易破损或堵塞影响分离效果［8］。

1.6 微流控技术法 微流控技术是一种新兴的微尺度分离技术，是在微流控技术的基础上结合声波、介电电泳或微流体黏性等特性发展起来的，可利用外泌体的大小、密度和黏滞弹性等参数的差异对其进行分离［20］。此法分离的外泌体具有所需样本小、检测速度快及检测成本低等优点，但是处理的样本量小、通量低且样品处理复杂。

2 外泌体的表征方法

目前有关外泌体表征方法的研究较多，目前研究的热点：一是外泌体表征方法的标准化，二是对来源受限珍贵样本（比如手指血、新生儿样本、泪液样本等）需开发高灵敏、信息化多元的定量方法，三是建立特异性、高通量和完整外泌体表征方法以促进外泌体的研究和临床应用［8］。目前可通过电子显微镜、动态光散射、纳米粒子追踪分析、流式细胞仪等对外泌体的物理形貌和尺寸大小特征进行直观表征或定量分析，对于其组分如RNA、蛋白质和脂类分子等生化特征，则用紫外吸收、电泳、qRT-PCR、蛋白质免疫印迹、酶联免疫吸附、蛋白质组学和脂类组学等方法进行定量表征。

2.1 电子显微镜和成像技术表征法 高分辨率的电子显微镜成像是观察外泌体形貌最常用的选择。其中，透射电镜比扫描电镜使用频率高。由于对电镜图像中单个囊泡手动分析比较费时，KOTRBOVÁ等［21］开发了一种半自动软件工具，它可以分析比周围环境更暗的囊泡，并将囊泡与电镜图像中的沉淀染色、蛋白质聚集体和其他杂质区分出来，但仍无法区分细胞外囊泡和脂蛋白颗粒。透射电镜不提供外泌体浓度信息且观察视野受限制。SOKOLOVA等［22］用扫描电镜观察人胚胎肾细胞系和骨髓间充质干细胞分离得到的外泌体。冷冻电镜可以在冷冻条件下通过电子显微成像清晰直接地展示出外泌体尺寸、形态和结构，且无脱水和染色步骤，对样本破坏性小。原子力显微镜通过抗CD41抗体功能化硅表面捕获含有CD41分子的胞外囊泡，检测其数量和粒径分布，其分辨率可以达到几纳米，比常规的流式的分辨率更灵敏。各种电镜均需要贵重的仪器、成本较高且通量较小。

2.2 动态光散射和纳米粒子追踪分析表征法 动态光散射是基于光谱学测定液体基质中悬浮颗粒物粒径分布的方法。动态光散射应用在蛋白质、外泌体等的粒径分析上具有简单、快速、重复性好的优点。但在测量时，小颗粒的光强度波动信号会被大的颗粒遮盖，所以不适合大小不均匀的异质性/多分散性样本［12］。纳米粒子追踪分析与动态光散射相似，检测囊泡粒径分布的同时也能检测颗粒物浓度［22］，其优点是不破坏外泌体的结构、检测速度快且样本制备简单等，缺点是无法区分蛋白颗粒和囊泡，检测到的浓度偏高。

2.3 流式细胞术表征法 流式细胞术用于表征外泌体表面标志蛋白、囊泡大小和数量分布等，也可通过荧光标记示踪外泌体［12］。特异性蛋白染料荧光标记后，不需要离心除去未结合的染料，直接通过流式检测结合荧光标记的囊泡。传统的流式细胞仪分析>200 nm颗粒时难以准确测量外泌体，研究者开发出纳米流式细胞仪，使用荧光探针的高荧光触发流式细胞仪可以检测外泌体和其它细胞外囊泡的大小和分布。流式细胞术检测用量少、快速，兼具高通量和特异性定量分析的优点，缺点是需要特殊设备，且尺寸计算有误差。

2.4 蛋白质免疫印迹和酶联免疫吸附定量分析表征法 利用紫外可见分光光度法、BCA和电泳对外泌体总蛋白质和RNA含量进行定量。蛋白质免疫印迹和酶联免疫吸附常用于外泌体表面标志蛋白鉴定和定量。常用的外泌体的标志蛋白是跨膜蛋白CD9、CD63、CD81和TSG101、ALIX等多泡小体发生蛋白［4］。ELISA的优势是灵敏度高、特异性强、时间短（4 h）、通量高（96孔板），但抗原需要两个或两个以上的抗原表位。Western blot法特异性高，可以同时检测蛋白的分子大小和丰度，但操作繁琐，耗时长（>10 h）。两种方法都依赖抗体，都存在交叉反应性的问题［8］。

2.5 微阵列和基于质谱的组学技术表征法 微阵列（即芯片技术）可用于研究外泌体DNA/RNA在毒理学和疾病的分子机制研究中的作用。其优点是通量高，可同时检测上万条RNA或DNA片段，缺点是价格昂贵，需要qRT-PCR实验验证或结合测序技术（NGS/RNA-seq）发现新的有功能RNA/miRNA序列。近年来，基于液相色谱-质谱/质谱连用（LCMS/MS）的组学分析逐渐广泛应用于分析外泌体的蛋白质组和脂质组，可用于特定蛋白质、糖蛋白和脂蛋白的确认与定量，并进一步研究外泌体携带货物分选、疾病和毒理标志物筛选等。

3 外泌体在环境毒理学中的应用

3.1 外泌体作为环境毒理学的生物标志物 化学品的暴露会改变外泌体的分泌及其成分，进而影响细胞周围的微环境的改变。BALA等［23］发现在酒精导致酒精肝动物模型中血清外泌体的miR155增加，药物诱发的肝损伤则会明显增加miR122的含量。ZHOU等［24］发现尿液外泌体胎球蛋白A的含量在急性肾损伤的动物模型和患者中都显著上升，在不同类型肾损伤尿液外泌体中不同转录因子表达存在差异。LV等［25］发现肾纤维化患者尿液外泌体miR29明显高于对照组。KULKARNI等［26］发现高剂量离子辐射暴露动物后血清和尿液外泌体呈现不同的生物标志物。因此，外泌体及其内含mi RNA/蛋白可作为化学品或药物导致相关疾病的毒理标志物。

3.2 外泌体为环境污染物暴露相关疾病的毒性机制提供模型 环境污染物如重金属、杀虫剂和有机溶剂等的暴露导致神经系统等相关疾病过程中，外泌体及其内含物可能参与这些疾病进程，为进一步揭示环境毒理机制提供依据。HARISCHANDRA等［27］发现锰的暴露促进培养神经细胞分泌外泌体，其中miRNA含量增加调控Tau蛋白聚集、自噬、炎症等过程，进而加快锰导致的帕金森病进程。FUJITA等［28］发现香烟烟气暴露的支气管上皮细胞产生的外泌体中miR-210，可在体外促进成纤维细胞的增殖分化。这些研究表明外泌体在香烟烟气导致纤维化和慢性阻塞性肺气的发病机制发挥重要作用。MUNSON等［29］发现石棉暴露肺上皮细胞和巨噬细胞分泌的外泌体可诱导间皮细胞癌变。重金属砷中毒患者血清外泌体miR155含量增加，导致正常干细胞的炎症反应，而过度炎症反应被认为是为细胞癌变提供微环境。LIM等［30］发现，室内污染物甲苯暴露早幼粒细胞白血病细胞，导致其外泌体多个miRNA异常表达，这些miRNA靶基因与癌症、神经系统、心血管和呼吸系统疾病相关。因此，外泌体及内含miRNA可为阐释环境污染物诱发疾病的机制提供依据。

综上所述，外泌体在生理、病理、毒理和临床治疗中发挥重要作用。目前已有多种外泌体分离和表征方法，但不能满足研究和临床需求，因此，需要开发简单、快速、高通量且不破坏外泌体结构的分离方法和更准确的表征方法，有利于其后期功能研究和应用。外泌体及内含生物分子可作为环境毒理学的生物标志物，可为今后研究环境污染物的毒性作用和机制研究提供模型。