血流感染的实验室诊断技术进展

郭鹰 江代红 郭富饶

重庆市巴南区人民医院检验科（重庆401320）

血流感染是由病原微生物侵入血液而导致的严重疾病，会造成血流障碍、器官衰竭甚至死亡，给社会带来了沉重负担［1］。近年来，发病率持续增加，全世界每年大约有3 000 万人罹患这一疾病。据统计，在美国，血流感染导致的死亡占医院死亡总数的1/3～1/2 之多［2］。高病死率的主要原因就在于疾病发生早期不能进行有效的抗生素治疗，目前临床采用的经验性广谱抗生素治疗不仅会利于耐药病原体的选择和传播，也会增加真菌感染的风险，同时还造成医疗资源的浪费［3-5］。

血流感染快速、明确诊断，病原微生物识别及药敏性分析是及时实行针对性抗生素治疗的前提，对于改善患者预后尤为重要。血培养作为血流感染诊断的金标准，其作用及价值早已被证实。但耗时耗力，且阳性率较低，难以实现快速诊断［6］。进入21 世纪后，分子生物学迅速发展，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术，基于核酸的技术（DNA 分子杂交和快速PCR 检测）等的出现彻底改变了传统微生物鉴定方法，大大缩短了所需的时间［7］。随着分子技术的不断进展，使得直接从血液样本中鉴别微生物甚至分析其药物敏感性成为可能。尽管用于血流感染的快速诊断新技术仍处于发展阶段，其临床应用潜力不容小觑，可为血培养提供补充或替代选择，在不久的将来或可完全替代传统方法，从而更好地服务临床。

本文分析了血培养技术的发展现状，总结用于血流感染样本的快速诊断技术最新进展，讨论这些技术的临床应用前景和面临的挑战，以期为提高和加快血流感染诊断和治疗提供新的思路。

1 “金标准”血培养

血培养是诊断血流感染的金标准。临床上高度怀疑血流感染的发热患者，需要通过血培养来进一步识别致病微生物及其药物敏感性，指导临床治疗。血培养一直被广泛应用，但整个过程耗时耗力，至少需要3～5 d 才能获得结果［8］。连续监测血液培养系统（CMBCS）的引入，使得大多数微生物，可在24 h 内获得阳性结果，加快了诊断进程。但依据目前的培养流程，在培养阳性后仍需要48 h 才能获得微生物鉴定（ID）及药物敏感（AST）结果［9］。传统血培养方法耗时太多，显然需要一种更好的方法，来实现快速诊断。

2 从阳性血培养物鉴定病原微生物的分子技术

目前的血培养方法需要将阳性培养物再次接种，过夜培养形成菌落克隆，再进行ID 和AST 检测。将阳性血培养物直接用来检测可以较当前方法提前12 ～24 h 获得结果。

2.1 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）MALDI-TOF MS 是应用在微生物鉴定中最广泛的质谱方法，具有方便、快速、准确的优势。通过测定蛋白、核酸质谱，与参考数据库中的质谱进行比较来鉴定微生物。最初，这种方法仅应用于培养基上的细菌菌落。但随着研究的进展，该技术已被用于直接从阳性血培养瓶中鉴定病原微生物，增加了它的实用性［10］。MALDI-TOF MS 被认为是极具前景的快速诊断技术，对不同种类微生物的阳性预测值可以达到60% ～80%［11］。现在已经有比较成熟的商业试剂盒，如Sepsityper®kit（Bruker Daltonics）和VITEK®MS blood culture kit（bioMérieux）［12］。已有文献报道基于MALDI-TOF MS 的自动、同时多相基因检测系统已被研发出来用于快速识别病原微生物及其耐药基因。利用MALDI-TOF MS 快速鉴定病原微生物已经被许多机构整合为常规测试，然而，目前尚无标准化的临床前处理方法，检测结果存在较大差异。另外，该方法不能适用于多重病原体感染的诊断［13］。

2.2 PCR 检测技术微生物核酸被提取、纯化和PCR 扩增，随后可通过高分辨率熔融曲线分析、微阵列杂交、凝胶电泳、序列分析或者实时定量PCR来快速诊断多种病原体感染［14］。另外，还可通过对16S 和（或）23S rRNA 的DNA 序列进行实时PCR扩增，然后进行焦磷酸测序以完成鉴定。研究表明，该方法与血培养结果的一致性达98.9%，敏感性为90.9%，特异性为99.6%［15］。在AST 检测方面，PCR 技术被用于检测甲氧西林、万古霉素耐药基因，对药物使用、患者疗效和成本效益具有积极的作用［16］。总的来说，基于PCR 的技术相对于传统血培养的主要优势包括更快的周转时间和在抗菌治疗期间更高的检出率［17］。但该技术也有着明显的缺陷，PCR 技术检测微生物种类有限。并且，这项技术成本较高，需要专业人员进行操作［18］。

2.3 肽核酸荧光原位杂交技术（PNA-FISH）PNA荧光原位杂交技术是一项最新的分子诊断技术，只需要1.5～3 h就可以从阳性血培养物中检测鉴定病原微生物［19］。PNA探针具有肽链骨架，与DNA 分子结合后，可以通过碱基互补配对原则高度特异地与细菌16S rRNA 及酵母18S rRNA 杂交。通过设计特殊的探针，包括葡萄球菌探针、肠球菌探针、革兰阴性菌探针、酵母探针等，可以快速识别血流感染患者阳性血样中的革兰阳性菌、革兰阴性菌和假丝酵母菌。在一项研究中［20］，作者用PNA荧光原位杂交技术快速鉴别光滑念珠菌（Cgl）和白色念珠菌（Cal），及时调整治疗方案，减少了不必要的棘球白素的使用。这一技术对于细菌和真菌都具有高度的特异性和敏感性，且快速、简单，易于整合到当前的诊断流程中，极具临床应用前景。当然，该技术还需要进一步研究以解决其技术缺陷，包括检出限不低于105CFU/mL、探针数量极其有限且目前不具备检测耐药基因的能力。

2.4 单细胞拉曼光谱技术拉曼光谱可在单细胞水平上对单核细胞和真核细胞进行拉曼光谱的检测，生成其唯一的生物分子“指纹光谱”，用来识别病原微生物。拉曼光谱具有快速、灵敏、无标记、无创、受水干扰小等特点，在多种病原微生物感染的诊断中也有着独特优势，并且拉曼光谱技术可用于识别耐药细菌。

中科院苏州医工所联合团队基于Raman-DIP原理，开发了一种快速药敏方法，可在21 h 内给出血样的药敏结果［21］。血培养阳性的样本加入到药敏板作用后再加入重水，易感菌代谢活动被抑制，拉曼图谱呈现C-H 峰，而耐药菌出现偏移的C-D峰。这种药敏分析是基于抗生素对细菌作用的表型，因此结果不会因未知的耐药机制或基因表达调控而产生对药敏的误判。

3 直接从血液中鉴定病原微生物的分子技术

治疗血流感染的关键就在于早期抗生素的使用，临床诊断后3 h 内开始治疗，可以显著降低患者病死率［22］。然而，研究表明，早期不合理的抗生素治疗会缩短患者的生存期［23］。因此，在疾病发生最初1～3 h 内快速完成实验室诊断十分必要。传统血培养鉴定受到培养阳性报警时间的限制，而直接从血液样本中快速检测则更具吸引力，可以将诊断时间缩短至数小时甚至数分钟内。

3.1 PCR-电喷雾电离质谱（PCR/ESI MS）PCR技术和ESI MS 技术结合可以用来直接识别血液样本中的病原微生物，完美结合了PCR 的高灵敏度和质谱的高准确度。运用该技术的IRIDICA 平台已经被开发商业化，可以在6 h 内，鉴定出常见的780 种细菌和念珠菌，但能识别的耐药基因只有四种（mecA、vanA、vanB 和blaKPC）［14，24］。首先从5 mL 全血样本中自动提取DNA，加入不同引物，通过PCR 分别扩增细菌和念珠菌的rRNA 基因，ESI MS技术测得扩增产物分子量，与数据库进行对比来鉴定微生物。这些引物和反应成分经过优化以减少人类DNA的干扰，提高扩增效率。METZGAR等［25］发现，PCR/ESI MS 与传统血培养的一致性达80%，并在46 例血培养阴性样本中检测到了病原微生物，有着更高的灵敏度。不过，该技术检测耐药基因的能力有限，还需要常规血培养后再进行AST。目前或可作为传统方法的补充手段，但不能完全替代。

3.2 液滴数字检测技术一种被称为“集成综合液滴数字检测”（IC 3D）的新兴技术声称可以在1～4 h 内直接从少量全血中选择性地检测单个细菌，不需要培养增殖，也不需要基因扩增。IC 3D将基于DNA 酶的传感器与实时液滴微胶囊和粒子计数器结合。首先，直接将血液样本分成数十亿含细菌及DNA 传感器的微米级液滴。传感器与细菌靶序列结合后产生荧光信号，达到识别鉴定细菌的目的。液滴技术可以很大程度地减少血样中其他物质的干扰，避免了分离纯化等繁琐步骤。在一项研究［26］中，作者用该技术检测大肠杆菌污染的血样，对于每毫升仅含一个细菌的样本，用时3.5 h，阳性率77%。该技术真正实现了简单、快速、单细胞灵敏度，不过目前该系统每次只能检测特定单一菌种，并且受限于荧光通道数量，可拓展能力差。

3.3 T2 磁共振T2 磁共振是一种小型化、基于磁共振的诊断技术，可在磁场存在时测量水质子T2弛豫信号变化。该方法包括PCR 扩增病原微生物特异性DNA 序列，然后将产物与超顺磁纳米粒子修饰探针杂交。杂交会导致纳米颗粒聚集，出现可检测到的变化，从而确定微生物的存在。T2 磁共振可以在不到5 h 内检测出复杂样本中含量极少的目标核酸［27］。科学家用T2 磁共振检测五种常见病原微生物（ESKAPE，E.faecium、S.aureus、K.peneumoniae、A.baumanii、P.aeruginosa、ENT），并与传统的血培养方法进行了比较。该技术的敏感性和特异性均为90%，血培养阴性而磁共振阳性的样本占10%。平均花费时间为3.6～7.7 h［28］。不过，该方法不能提供微生物的耐药信息，且费用昂贵。未来的研究需要评估这些局限性是否可以克服，并进一步验证这种方法在其他种类病原微生物检测中的应用。

3.4 微流控技术血液中病原微生物的浓度远低于红细胞、白细胞、血小板等，有效分离是诊断的关键步骤。在一项研究中，作者用集成的微流控芯片技术快速分离血液中的革兰阳性菌和革兰阴性菌。该技术包括一个膜过滤模块、细菌捕获模块和PCR 扩增模块。通过膜过滤分离血浆，再用甘露糖结合凝集素修饰的磁珠捕获细菌，最后实时荧光定量PCR 识别细菌。滤过膜可以去除所有的白细胞和99.5%的红细胞，细菌捕获率接近85%，PCR 检出限为每个反应5 CFU，整个过程只需4 h［29］。与血培养方法相比，该技术可以在更短的时间内检测出血液样本中低浓度的病原微生物，更大程度地发挥PCR 技术的优势［30］。当然，该技术还需要进一步的临床研究来证明其价值。

另外，微流控技术也可以与生物芯片技术结合，将微生物的收集、培养、扩增以及识别鉴定在复杂体系内一步完成。生物芯片技术是将生物大分子固定于固相介质上形成分子点阵，样品与探针分子发生相互作用后信号被采集分析。生物芯片可以分为基因芯片和蛋白质芯片，具有高通量、微型化和平行分析的特点，在微生物鉴定及耐药基因分析中发挥越来越重要的作用。

4 结论

血流感染诊断的理想标准是3 h 内快速识别细菌、真菌、病毒等微生物及其药敏性，以便及时选择有效的抗生素进行治疗，改善患者预后。分子技术的发展，使得快速诊断更趋向于理想标准。不过，每种技术都有其独特的优势和缺陷。这就需要不同技术联合使用以及不同领域之间的协调合作，科学家研究开发新的技术，临床医生综合考量临床指标和实验室指标［31］，实验室工作人员掌握并积极使用新的检测方法，工程师制造自动化检测设备，行业内制定相关的标准流程。总之，各种新兴分子技术有足够潜力实现血流感染的快速诊断，但目前仍需作为血培养的辅助手段，不断在临床上进行验证以获取更多的数据，为日后替代传统方法提供依据。