猪瘟病毒实验室诊断技术研究

2021-01-10李雪，康路

饲料博览 2021年3期

李雪，康路

（1.盘锦市大洼区现代农业发展中心，辽宁盘锦 124200；2.盘锦市大洼区动物卫生监督所，辽宁盘锦 124200）

猪瘟主要是一种由猪瘟病毒引发的高度传染性疾病，该病死亡率极高，类型较多，诊断困难，一旦诊治不及时，容易导致生猪的群体性死亡，对生猪养殖的危害极大。本文通过对猪瘟病毒分离与鉴定实验室诊断技术的分析，为生猪养殖业猪瘟疫病的诊断提供参考，以确保猪瘟疫病防治工作的有效性。

生猪养殖业受猪瘟的影响，直接经济损失非常大。因此，要想彻底根除猪瘟，除了要建立完整的生物安全制度，认真研究猪瘟的流行病学外，还必须通过猪瘟病毒实验室诊断技术的研究，以确定不同猪瘟病毒检测技术的优势和缺点，筛选出检测准确度高、操作简单、检测速度快、成本较低的检测技术。

1 猪瘟病毒ELISA实验室诊断技术

酶联免疫吸附试验（ELISA）是检测抗体的一项技术，在大型养猪场应用较多，结合ELISA的实验原理，在其基础上发展出了多种检测方法。现阶段在猪瘟病毒抗体和抗原检测中，已经形成多种ELISA检测方法，在生猪养殖疫病研究和防治中起到了关键性的作用。

1.1 间接ELISA抗体检测方法

该检测方法是将已知的猪瘟病毒抗原进行包被，将制备好的血清加入孔中，等到反应完全后，滴入带有过氧化物酶标记的葡萄球蛋白A，待血清变色后，读取酶标记，得出检验的结果。研究人员使用猪瘟兔化弱毒株进行间接ELISA 实验，提取HCLV 的E2 基因，然后插入到pEI-32a 原核，建立一个新的pEI-2e，使其变成一个宿主菌BL21（DE3），最后在不同的诱导条件下，进行TPTG 表达，获取多个诱导结果。通过对诱导蛋白结果的比对，得到最好的诱导条件，以保证菌体蛋白总量达到实验的预期结果。并将在最佳诱导条件下获取的蛋白CSFV 抗原进行包被，到此完成间接ELISA 抗体检测。有相关研究人员使用间接ELISA 检测法，对100份血清进行实验，证实该方法诊断的灵敏性好、反应体系小、实验速度快，并解决了原来CSFV培养和纯化难度大的问题。

1.2 Dot-ELISA抗体检测方法

该方法与ELISA接近，不同之处是将ELISA的固相载体，转换为Dot-ELISA的混合纤维素膜，该方法比间接ELISA的实验操作更简单。有研究通过使用Dot-ELISA抗体检测方法，在一个大型养猪场进行猪瘟病毒免疫母猪抗体水平检测实验，获取45份血清，经Dot-ELISA检测后，母猪血清阳性为32份，检出率为71%，从而证明Dot-ELISA检测的有效性，其是一种操作简单、快速、检出率高的检测技术，适用于大型养猪厂的日常防疫工作。

1.3 微波ELISA抗体检测方法

微波ELISA 与间接ELISA 实验操作流程相同，只不过微波ELISA法需将血清放入微波炉中进行温育，进一步加快血清的反应速度，对间接ELISA进行了改进，以促进微波ELISA抗体检测法在大型生猪养殖场的推广和应用。

1.4 竞争ELISA抗体检测方法

将制备好的血清和特异酶标单抗同时，或者是先后与包被抗原结合反应，如果血清中含有抗体，则会起到抑制作用，阻碍包被和抗原发生反应，依据阴阳性样品的OD值，计算出血清特异性抗体的抑制率，进而确定阳性血清中抗体的百分比，以及计算出结合力。竞争ELISA 法在阳性血清显色时，要比间接ELISA 法的颜色淡，OD 值也低。竞争ELISA法在检测猪瘟抗体时，没有感染性，非常适用于没有猪瘟的地区。

2 分离和鉴定猪瘟病毒的实验室诊断技术

对猪瘟病毒进行分离和鉴定是实验室经常用到的一种诊断技术，解剖获取病猪含有病毒最多的器官组织，如扁桃体、淋巴结等，加入双抗后，研磨成3%～10%的液体，使用离心设备处理，提取上层清液，再滤除其中的杂质，并进行除菌。另一种方法是将解剖获取的病猪血样，经EDTA 处理，在-20 ℃进行冰冻后，再放入37 ℃的温水中融化，提取病毒放入猪睾丸细胞中，置于37 ℃恒温容器中培养1 h，去除接种液，放入MEM洗涤细胞，加入生长液，进行培养和观察。如果细胞没有病变，在48 h后取出细胞片，使用免疫酶染法进行检测，可以获取培养后细胞中的病毒抗原，或者将分离出的病毒接种在健康的生猪体内，观察其感染病毒后的变化，则可以确定猪瘟的类型。分离和鉴定的实验方法操作复杂且成本较高，虽然诊断准确，但是在病毒传代时，极易引起病毒发生变异，导致病毒核酸序列分析的不准确，需要研究人员密切地关注实验过程。