慢性间歇性低氧对心肌梗死急性期小鼠C1q肿瘤坏死因子相关蛋白9 的表达及对心功能的影响

李泽萱 杜芸辉 黄 鑫 李思懿 王 晓 聂绍平

阻塞性睡眠呼吸暂停(obstructive sleep apnea，OSA)是一种常见的睡眠呼吸障碍，其特点是睡眠过程中上气道完全或部分阻塞导致反复呼吸暂停和/或呼吸浅慢。 OSA 引起心血管损害的主要机制是慢性间歇性低氧(chronic intermittent hypoxia，CIH)。然而，OSA 对于心肌梗死急性期的心肌损伤是否存在影响目前仍存在争议。 有研究显示，在非致命性心肌梗死患者中，OSA 可能通过缺氧预适应诱导心肌形成微血管从而减轻心肌损伤[1-2]。 C1q 肿瘤坏死因子相关蛋白9(CTRP9)是一类与脂联素高度同源的脂肪因子[3]。 既往研究显示，缺血性心肌损伤后血浆CTRP9 水平下降，在CTRP9 水平升高或降低的情况下，心肌梗死的面积可以相应的减小或增大[4]。 本研究通过观察在CIH 暴露下，小鼠心肌梗死急性期CTRP9 的表达及心功能的变化，以评价OSA 对心肌梗死急性期心肌损伤的作用。

材料与方法

1.研究材料 (1)实验动物 选取健康SPF 级雄性C57BL/6 WT 小鼠，6 ～8 周龄，体质量(25±3)g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司。 实验动物在首都医科大学附属北京安贞医院实验动物房内正常饲养，动物房内温度控制在23 ～26 ℃，相对湿度控制在60%，环境安静、通风干燥，昼夜节律12 h 循环，动物自由摄取水和无菌饲料，符合实验动物伦理委员会的要求。

(2)主要实验试剂 蛋白定量试剂盒、反转录试剂盒购于赛默飞世尔科技有限公司；SYBR Premix Ex Taq II 购于日本TAKARA 公司；GAPDH多克隆抗体购于北京中杉金桥公司；CTRP9 多克隆抗体购于美国Aviscerbabio Science 公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗购于美国Licor 公司；小鼠血浆的CTRP9 ELISA 试剂盒购于南京建成生物工程研究所有限公司；MASSON 三色染色试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司。

2.方法 (1)动物分组 按照随机数字表法将小鼠随机分为低氧组(CIH， n ＝18) 和常氧组(NOR， n ＝18)。 CIH 组小鼠在低氧舱中饲养28 d后，接受心脏左冠状动脉前降支结扎手术，术后再次暴露于CIH 环境3 d(CIH-MI 3 d，n ＝6)、7 d(CIHMI 7 d， n ＝6)和14 d(CIH-MI 14 d，n ＝6)。 NOR 组小鼠于正常环境中饲养28 d 后，接受心脏左冠状动脉前降支结扎手术，术后再次于正常环境中饲养3 d(NOR-MI 3 d，n ＝6)、7 d(NOR-MI 7 d， n ＝6)和14 d(NOR-MI 14 d，n ＝6)。

(2) 干预方法 采用 OxyCycler A84(BioSpherix，USA)动态编程三气动物培养箱建立CIH 模型。 将CIH 组小鼠放入培养箱内，由电脑软件按照设定的气体浓度-时间曲线使舱内氧气浓度6%～21%之间循环。 CIH 组小鼠每天在培养箱内8 h，持续28 d，舱内温度、湿度与室内相同。 NOR 组放于常氧环境中，干预时间与CIH 组相同。

(3)动物模型制备 提前对全部小鼠进行左胸部脱毛处理，使小鼠在3.0%异氟烷吸入麻醉后取仰卧位，头部和四肢固定于手术台上，使用呼吸麻醉机维持麻醉状态，于胸骨左缘扪及心脏搏动处纵行切开皮肤，然后逐层钝性分离肋间肌肉，于第四肋间打开胸腔，拇指食指轻微用力将心脏挤出胸腔。 以左心耳下缘为标志，左心耳根部下2 ～3 mm 用6-0无创缝线穿过左冠状动脉前降支，进针深度0.5 mm，术中可见结扎线以下心肌颜色变白，可初步认为心肌梗死建模成功，即可将心脏送回胸腔内。 最后，用3-0 无创缝线常规结扎关闭胸腔。 将麻醉状态解除后查看小鼠能否自主呼吸。 小鼠术后注意保温，避免搬动，待其清醒。

表1 各组小鼠心脏多普勒超声检测结果的比较

表1 各组小鼠心脏多普勒超声检测结果的比较

注:与MI 3 d 组比较，*P＜0.05；与MI 7 d 组比较，＃P＜0.05

NOR项目MI 3 d(n＝6)MI 7 d(n ＝6)MI 14 d(n ＝6)CIH F 值 P 值MI 3 d(n ＝6)MI 7 d(n ＝6)MI 14 d(n ＝6)F 值 P 值LVIDd/mm 3.6 ±0.2 4.0 ±0.7 4.9 ±0.3*＃ 10.721 0.001 3.3 ±0.3 4.4 ±0.2* 5.2 ±0.2*＃ 76.806 0.000 LVIDs /mm 3.4 ±0.3 3.5 ±0.6 4.4 ±0.3*＃ 10.510 0.001 2.6 ±0.3 4.3 ±0.3* 4.9 ±0.3*＃ 90.852 0.000 LVPWd /mm 1.5 ±0.4 1.6 ±0.6 1.8 ±0.5 0.352 0.709 1.3 ±0.4 1.8 ±0.6 2.0 ±0.7* 2.513 0.562 LVPWs /mm 1.7 ±0.4 1.9 ±0.6 2.0 ±0.4* 0.549 0.589 1.4 ±0.4 2.2 ±0.5* 2.2 ±0.9* 3.286 0.605 FS/% 17.1 ±2.7 13.7 ±0.8* 10.4 ±1.6*＃ 19.893 0.000 21.2 ±3.3 14.2 ±1.5* 9.7 ±0.5*＃ 46.478 0.000 LVEF/% 37.3 ±5.3 29.2 ±1.6* 22.8 ±3.3*＃ 22.891 0.000 45.3 ±4.8 30.8 ±3.1* 21.3 ±0.9*＃ 78.459 0.000

图2 CIH 和NOR 组小鼠冠状动脉结扎后3 d 的心脏多普勒超声检测结果注:与NOR 组比较，*P＜0.05；与NOR 组比较，**P＜0.01

(4) 心脏多普勒超声检测 采用实验动物房VisualSonics Vevo 2100 型超声仪对小鼠进行心脏多普勒超声测量。 将小鼠称重后麻醉左胸前脱毛，固定于操作台，调整探头角度以获得左心室的长轴切面，然后将探头顺时针转动90°，获得左心室短轴的各个切面。 数值取测量三个心动周期的平均值。

(5) MASSON 染色 麻醉并固定动物，剪开胸腔，充分暴露心脏，剪开右心耳，用0.9%氯化钠液经心尖灌流至肝脏组织发白后，剪下心脏，置4%的多聚甲醛溶液中24 h 固定，包埋后切成厚度约5 μm 的石蜡切片，脱水并进行MASSON 染色。 镜下可见胶原纤维成分呈蓝色，正常心肌呈红色。

(6) Western blot 法检测小鼠心肌CTRP9 蛋白表达水平 提取小鼠心肌组织蛋白，冰上裂解，制备心脏组织匀浆，离心后取上清液存于EP 管中。 采用BCA 法测定蛋白浓度，加裂解液保存于-80 ℃冰箱备用。 进行SDS-PAGE 后，将蛋白转至PVDF 膜上。 用5% BSA 封闭1 h 后，孵育相应一抗4 ℃慢摇过夜，恢复室温后，TBST 清洗，室温慢摇1 h 孵育二抗，胶片发光，并用Image 分析软件进行各条带吸光度值计算。 目的蛋白均与GAPDH 蛋白校准。

(7) RT-PCR 法检测小鼠心肌CTRP9 mRNA 的水平 取各组小鼠心脏，用TRIzol 提取心肌的总RNA，用反转录试剂盒将每组2 mg 的总RNA 反转录为cDNA。 把反转录产物稀释1 倍，利用荧光定量PCR 仪进行PCR 反应。 每个样品设3 个复孔。目的基因均与GAPDH 基因的表达进行校准。

(8) ELISA 法检测小鼠血浆CTRP9 浓度 心脏取材前，用经肝素润管的注射器在心尖搏动最强处进针，由于心脏跳动使血液泵入注射器，可取约1 mL 血液，并立即在4 ℃下离心，后将血浆冷冻在-80 ℃下进行后续测定，避免重复冻融循环。 使用ELISA 试剂盒通过夹心法测定血浆CTRP9 浓度。样品一式两份进行测定。

3.统计学方法 采用统计软件SPSS 25.0 和GraphPad 7.0 软件处理。 计量资料均数±标准差表示，比较用非配对t 检验；多组之间的比较用多因素方差分析。 计数资料以频数(率)表示。 以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.各组小鼠心脏多普勒超声检测 结果显示，在冠状动脉结扎3、7、14 d 后，CIH 组和NOR 组小鼠的舒张期左心室后壁厚度(LVPWd)和收缩期左心室后壁厚度(LVPWs)均无显著改变。 两组小鼠的LVIDd 和LVIDs 均逐渐增加(均P ＜0.001)，LVEF 和短轴缩短分数(FS)均逐渐减少(均P ＜0.001)，提示小鼠左心室扩张、心功能减低(图1，表1)。 此外，冠状动脉结扎术后3 d，CIH 组小鼠的LVEF 和FS 均显著高于NOR 组(均P ＜0.05)，LVIDs 明显低于NOR 组(P＜0.01)。 LVIDd 和左心室后壁厚度无显著改变(图2)。

2.各组小鼠心肌纤维化程度 在冠状动脉结扎术后3 d，CIH 组小鼠心肌纤维化的面积比例明显小 于 NOR 组[(0.79 ± 0.0016)% vs.(4.48 ±0.0167)%，P＜0.001，图3]。

3.各组小鼠心肌组织CTRP9 表达水平 在CIH 组和NOR 组中均可观察到相较于MI3d 组，MI7d 组CTRP9 的蛋白表达水平均上调(CIH: P＜0.05；NOR: P＜0.01)。 在MI 3 d 时可发现，CIH 组小鼠心肌组织的CTRP9 蛋白表达水平高于NOR 组(P＜0.05，图4)。 小鼠心肌组织中CTRP9 mRNA 的表达水平也发现了同样的规律，MI7d 组小鼠的CTRP9 mRNA 水平高于MI3d 组(CIH: P ＜0.05；NOR: P＜0.01)， 可能预示着心肌损伤严重程度从心肌梗死后急性期到亚急性期或愈合期的恢复。 此外，在MI 3 d 时CIH 组小鼠心肌组织的CTRP9 mRNA 表达水平也高于NOR 组(P＜0.05，图5)。

4.各组小鼠血浆CTRP9 浓度 冠状动脉结扎术后7 d，CIH 组和NOR 组小鼠的血浆中CTRP9 的浓度均高于冠状动脉结扎术后3 d(CIH: P＜0.05；NOR: P＜0.01)。 在心肌梗死急性期时，CIH 组小鼠的血浆CTRP9 浓度高于NOR 组(P＜0.01)，图6。

图3 小鼠冠状动脉结扎后3 d 的Masson 染色 A:CIH 组，B:NOR 组

图4 各组小鼠心肌组织中CTRP9 蛋白表达水平 A:各组心脏中GADPH 和CTRP9 的表达水平；B:各组心脏中CTRP9/GADPHA 的量化结果注:与NOR＋MI 3 d 组比较， *P＜0.05；与NOR＋MI 3 d 组比较， **P＜0.01；与CIH＋MI 3 d 组比较，＃P＜0.05

图5 各组小鼠心肌组织中CTRP9 mRNA 表达水平 注:与NOR＋MI3d 组比较， *P＜0.05；与NOR＋MI 3 d 组比较，**P＜0.01；与CIH＋MI 3 d组比较，＃P＜0.05

图6 各组小鼠血浆中CTRP9 浓度 注: 与NOR＋MI 3 d 组比较，**P ＜0.01；与CIH＋MI 3 d 组比较，＃P＜0.05

讨 论

本研究发现，与NOR 干预相比，在结扎冠状动脉前后均进行CIH 干预的小鼠心肌纤维化面积显著减少、LVEF 明显提高，主要体现在心肌梗死后3 d。 此外，在心肌梗死急性期，CIH 组小鼠心肌组织和血浆中的CTRP9 水平显著升高。 本研究提示CTRP9 可能参与CIH 在心肌梗死急性期的保护作用。

OSA 是一种常见的睡眠呼吸障碍，多发于肥胖人群，并且与心血管疾病密切相关。 一项多中心临床研究证实，在全球范围内有约9.36 亿成年人患有轻度至重度OSA，其中4.25 亿为中度至重度OSA，而中国则是患病率最高的国家[5]，在急性冠状动脉综合征患者中的患病率达54%～69%[6]。 OSA 可以通过多种病理生理学因素来参与心血管疾病的发生，包括CIH、睡眠片段化和胸内压力波动，从而导致心脏和肺血管血流动力学改变[7]。 大量临床研究证实，OSA 可引起亚临床心肌损伤，是远期心功能不全和死亡的危险因素[8-9]。 但是一些基础实验发现，在心肌梗死急性期缺氧预适应可能对心脏保护产生正面影响，可能与侧支循环的形成、激活心肌细胞自噬或与增强抗氧化酶表达有关[2，10]。 例如，Estrada 等[11]对狗进行了为期20 d 的间歇性低氧训练后(每天5～8 次，每次持续5～10 min 中度低氧，4 min 的常氧暴露)，将左冠状动脉前降支闭塞60 min，然后再灌注5 h。 结果发现CIH 使心肌梗死面积从(41±5)%急剧降低至(1.8±0.9)%(P ＜0.001)。 类似的，在Béguin 等[12]实验中，经过CIH预处理的大鼠，在随后的缺血-再灌注损伤中心肌梗死面积明显减小。 Chang 等[10]的研究结果表明，于每30 min 氧气浓度在5%～20%之间循环的环境中培养大鼠原代心肌细胞，可以发现CIH 可以通过上调抗氧化酶的作用，保护心肌细胞免受H2O2-和缺血-再灌注诱导的氧化应激和细胞死亡。 以上研究表明，短暂暴露于轻度CIH 可以保护心脏免受更严重的缺氧和局部缺血的影响，即心脏可以适应短暂的、适当深度的间歇性低氧反应，增强心肌对后续更严重缺血性事件的耐受性，从而发挥心脏保护作用[13]。 在本研究中，可能由于永久性高位结扎冠状动脉对小鼠心肌造成的缺血损伤更为严重，所以仅在心肌梗死急性期观察到明显的缺氧预适应对心功能的改善作用。

CTRP9 属于脂联素旁系同源的CTRP 家族，较脂联素在心肌组织中的表达更为显著，可以参与调控与肥胖相关的代谢紊乱或心血管疾病[14]。 Zhao等[15]在CTRP9 敲除小鼠模型中探索了心源性CTRP9 在心肌损伤中的作用。 小鼠体外模拟缺血/再灌注后，心脏CTRP9 的表达下降，而其过表达则改善了左心功能不全和心肌细胞凋亡。 在非酒精性脂肪肝模型中，CTRP9 通过AMPK 调控自噬抑制内质网应激，减轻了肝脂肪变性，减少细胞凋亡[16]。CTRP9 主要通过促进AMPK 磷酸化抑制心肌细胞凋亡，发挥心脏保护作用，AMPK 活性的阻断消除了CTRP9 对心肌细胞凋亡的抑制作用[17]。 本研究发现，经过CIH 干预的小鼠在心肌梗死的急性期内，心脏保护因子CTRP9 的表达较NOR 组更多。 这可能是由于CIH 组发生缺氧预适应，使心肌CTRP9 表达增多，通过激活AMPK 依赖的自噬过程，抑制心肌细胞凋亡，减少心肌梗死面积，改善心功能。

综上所述，CIH 干预在心肌梗死急性期可能发挥心脏保护作用，表现为梗死面积减少及心功能改善。 CTRP9 可能在CIH 保护心肌损伤中发挥关键作用[18]。 仍需进一步研究CTRP9 参与CIH 改善心肌损伤中的作用机制。