结核性脑膜炎分子诊断研究进展

杨 翰，李爱芳，张永峰，党丽云，任 斐，杨元利

(西安市胸科医院，陕西 西安 710100)

2020年WHO全球结核病报告中指出[1]，在世界范围内，结核病仍然是导致高发病率和病死率的最重要的传染病之一。2019年，全球估计1000万人罹患结核病。人类免疫缺陷病毒(HIV)阴性的人群中有120万人死于结核病，HIV阳性人群中有208 000人死于结核病。肺外结核的感染中，结核性脑膜炎(Tuberculous meningitis，TBM)具有较高的致残率和病死率[2]。TBM是最严重的结核病形式，通常需要紧急干预，由于结核分枝杆菌可以通过血液快速传播，临床表现为颅神经损伤、精神状态改变、脑梗死、持续发烧、卒中，且预后很差。文献报道，TBM在成年患者的治疗结果中，死亡风险为24.7%(95%CI：18.7～31.9)，幸存者中神经系统后遗症的风险为50.9%(95%CI：40.2～61.5)，被诊断为III期或HIV阳性的患者在治疗期间死亡的可能性明显更高(分别为64.8、53.4%)[3]。不幸的是,TBM很难诊断，因为它与其他神经系统疾病的临床表现相似。TBM的非病原学检测技术在临床应用中较为广泛，主要为基于机体免疫应答产生的各类非特异性及特异性细胞因子、免疫细胞等。在50%以上的患者中通常很难使用常规方法在脑脊液(Cerebrospinal fluid,CSF)中出分离结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)[4]。近些年来，TBM诊断技术不断更新，以临床标本为检测对象，以MTB相关基因为诊断标志物，完成对标本中是否含 MTB 核酸或耐药基因检测的方法，对实验室的生物安全要求低于多种传统的细菌学诊断方法，因而具有广阔的临床应用前景。

1 基于实时荧光定量聚合酶链式反应技术的分子诊断

实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)技术通过使用特异性引物扩增带有荧光基团的特异性序列IS6110，IS6110只存在于 MTB 复合群，对于结核病诊断的灵敏度和特异度较高，可用于鉴别诊断 MTB 与非结核分枝杆菌(Nontuberculosis mycobacteria，NTM)[5]。通过对MTB的相关耐药基因片段扩增(利福平ropB，异烟肼AhpC、inhA、KatG，乙胺丁醇embB，链霉素rpsL、rrs，氟喹诺酮gyrA，二线注射类药物eis)，利用熔解曲线及多色半巢式技术检测耐药基因的突变情况，快速获得与抗结核药物耐药性相关的结核分枝杆菌基因组突变信息，为确定结核病患者临床治疗决策提供可靠的依据。

1.1 常规qPCR技术 常规qPCR技术通过对CSF标本中可能存在的MTB进行核酸提取，扩增特异性序列IS6110，该方法对于TBM的诊断效能较高[6]。有文献[7]报道，以临床诊断为金标准，qPCR敏感度(91%)要高于培养(63%)、MPB64蛋白(34%)及hsp65Kda(46%)等检测方法，同时qPCR中核酸的提取方法导致核酸质量的差异也是影响其敏感性的重要因素。常规qPCR技术具有大通量的优势，检测时间3～6 h，但其使用对于试验场地具有严苛要求，使得该类方法仅能在具有资质的核酸实验室进行，限制了该类方法在基层医院的推广。

1.2 GeneXpert MTB/RIF技术 GeneXpert MTB/RIF(简称Xpert)是一种快速、半定量、操作简便的检测方法[8]，实验场地要求不高，整个检测流程仅需1～2 h，被世界卫生组织2010年批准用为推荐的MTB检测分子学方法。Hernandez等[9]对30项研究进行Meta分析(包括5项队列研究和25项横断面研究)，系统回顾Xpert对结核性脑膜炎的诊断准确性，对于明确的TBM病例经过QUADAS-2 工具分析，Xpert敏感性为85%(95%CI：70%～93%)，特异性为98%(95%CI：97%～99%)，阴性似然比为0.15(95%CI：0.04～0.27)；疑似TBM病例敏感性为81%(95%CI：66%～90%)，特异性为99%(95%CI：97%～99%)。Xpert MTB/RIF Ultra(Xpert Ultra)是Xpert的下一代产品，使用多拷贝IS1081和IS6110片段为MTB目标序列。相较于Xpert(112.6 CFU/ml)，Xpert Ultra(15.6 CFU/ml)具有更低的检测下限[10]。WHO同时在2017年3月推荐使用Xpert Ultra代替Xpert。在肺外结核检测应用中，Xpert Ultra具有更高的敏感性、特异性。有研究[11]显示，培养阳性的病例中Xpert Ultra与Xpert的敏感性分别为83.7% (95%CI：68.7～92.7) 和 67.4% (95% CI：51.3～80.5)，特异度分别为92.0%(95% CI：72.5～98.6)和96.0%(95% CI：77.7～99.8)，特异度分别为92.0%(95% CI：72.5～98.6)和96.0%(95% CI：77.7～99.8)，Xpert Ultra具有明显的优势，对于TBM的诊断[12-13]，相比较于其他传统方法同样具有更高的敏感性。GeneXpert平台用于TBM检测的优势十分明显，一次腰椎穿刺获得标本量有限，但需检测项目较多(常规、生化、微生物、病理等)。GeneXpert平台使用1.5 ml标本直接上样检测，2 h内报告结果，样本间检测可单独进行，高灵敏度、特异度及利福平分子药敏结果，试验场地无特殊要求等，这些技术特点使得GeneXpert平台成为目前为止各级别医院首选检测手段。

1.3 恒温扩增技术 因PCR 技术需要反复的热变性，无法摆脱精良仪器设备的依赖，从而限制了其在临床现场检测中的应用，无须热变性的核酸恒温扩增技术则克服了这一困难。目前应用于结核分枝杆菌检测较成熟的恒温扩增技术包括环介导等温扩增反应(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，以RNA为模板的实时荧光核酸恒温扩增检测技术(Simultaneous amplification and testing,SAT)。在TBM诊断中，高漫等[14]、欧维正等[15]、张海晴等[16]研究表明，SAT技术的敏感性低于Xpert及qPCR技术，但高于传统的培养及涂片，这与SAT技术的RNA靶标有关，与传统的基于DNA模板的核酸扩增技术相比，其优点为[17-18]：①对仪器的要求低，操作简便，稳定性和结果准确性高；②起始靶标为环境中极易降解的RNA，可有效避免污染；③因RNA只在活菌中存在，SAT还可监测疾病活动性及药物疗效；④RNA拷贝数比DNA的拷贝数高，并且荧光标记的RNA探针可同步检测扩增信号，提高检测敏感性。由于RNA降解快，如果患者的脑脊液含菌量不多，而SAT操作时间控制不当，如放在核酸提纯仪中超声处理留置时间过长，也可能会造成SAT对MTB的检出率下降[19]；另外，若样本中或容器内存在核酸扩增抑制剂，检测出现假阴性的可能性会增加。LAMP技术使用六个特异性引物用于识别结核分枝杆菌IS6110基因组序列，包括一个正向外引物、一个反向外引物、两个相应的内引物和两个环引物，反应温度和时间分别为63 ℃和60 min(反应温度和时间在不同引物组合间存在差异)，使用商业试剂盒针对结核分枝杆菌的IS6110区域进行巢式聚合酶链反应可以在任何实验室、基层医疗机构中进行[20]。有研究[21]表明，172例诊断为结核性脑膜炎病例中抗酸染色(AFB染色)、MGIT 960培养、LAMP和聚合酶链反应(RTFQ)对结核分枝杆菌诊断的敏感性分别为2.91% (5/172)、12.79% (22/172)、43.02% (74/172)和34.30% (59/172)。LAMP对TBM的敏感性明显高于AFB染色和MGIT960培养(χ2=75.11,P<0.001；χ2=43.88,P=0.002)，而LAMP与RTFQ差异无统计学意义(χ2=2.08,P=0.130)。LAMP诊断TBM的特异性为92.86% (26/28)，阳性预测值为97.37% (74/76)，阴性预测值为20.97% (26/124)。LAMP和RTFQ诊断结核性脑膜炎的总体一致性为88.5%，Kappa值为0.870。LAMP与MGIT960培养的一致性为71%，Kappa值为0.730。在所有方法中，LAMP具有较高的敏感性、特异性和阳性预测值，与MGIT960培养和RTFQ具有高度一致性。多靶点LAMP的应用对TBM病例的诊断更具有优势。除了上述两种临床常用恒温检测技术外，目前商品化试剂还有结核分枝杆菌DNA实时荧光恒温扩增检测[22]，恒温扩增微流控芯片技术[23]，交叉引物恒温扩增技术[24]等。恒温扩增技术是高扩增效率酶发现带来的产物，高效率酶配合引物设计的合理性，使得DNA扩增效率要高于PCR技术，也使得检测敏感度更高、扩增仪器不受限，可在基层医疗机构筛查中推广使用。

1.4 高分辨熔解曲线技术 荧光PCR探针高分辨熔解曲线法 (High resolution melt curve analysis,HRM),一方面可以对抗结核分枝杆菌一线、二线药物耐药基因进行熔点变化分析，判定相应基因是否发生突变[25]；另一方面可通过对gyrB基因进行熔点变化进行分类及鉴别细菌[26]。国内外的研究表明HRM技术相比较传统的涂片、培养来说提高了脑脊液病原体检出的阳性率(1.8%涂片、10.9%培养和83.63%HRM[27])，同样提高了结核分枝杆菌的耐药筛查率。HRM分析是一项对技术人员水平要求较高的技术，溶解温度不同带来荧光信号曲线变化，专业技术人员可以从不同类型的曲线形式获得更多的信息，如不均一耐药及所占比例。亦或是在失败的扩增中，如何调整整个体系构建(主要是核酸的纯度及浓度的调整)，从而获得精确的分子耐药信息，确定是无法获得准确耐药位点突变类型。

2 基于杂交技术的分子诊断

利用碱基配对原则，将待检分子与已知序列分子探针进行杂交，通过对杂交产物的检测，获得待检标本中存在的核酸分子的信息。其优势在于多靶标的分析，随着载体材料的不断发展，靶标高度集成，优势也越发显著，尤其是突变分子或 SNP 的检测与分析。主要应用于结核分枝杆菌病原学检测，以及耐药基因突变检测[28]及分枝杆菌菌种鉴定[29]。杂交技术的优势在于能够获得特定位点的突变信息，但这也成为了缺点，除了特定位点外无法获得更多的信息。

2.1 线性探针法 将生物素标记PCR产物变性后与固定在膜上的特异寡核苷酸探针杂交，通过杂交信号而获得序列信息，酶免疫显色法显示结果，但受膜上探针的限制，不能检测出所有的突变类型。研究[30]显示，其对 MTB 检测的敏感性>95%，特异度为 100%，且可用于快速检测抗结核一线药物(敏感性和特异度方面：RFP为100%，50%，INH为86.11%，47.06%)、氟喹诺酮类(87.5%、94.7%)及二线注射药物(88.9%、98.9%)耐药相关的分子诊断。线性探针法同样属于杂交技术的一种，仪器的特殊需求限制了临床实验室的应用，但其较高的敏感性、特异度具有一定的价值。

2.2 基因芯片技术 将样品DNA或RNA通过PCR反应扩增并进行荧光标记，然后与芯片探针杂交再用扫描仪扫描杂交信号，通过软件分析得到基因表达或突变的相关信息，主要应用于耐药筛查及菌种鉴定。其对利福平、异烟肼、卡那霉素均具有高灵敏度及特异度，但对阿米卡星及卷曲霉素、氟喹诺酮的灵敏度较低[31]，能够鉴定常见十几种NTM菌种[32]。在TBM诊断中，基因芯片法具有阳性率高，准确性高等优势[33]。以Bactec MGIT 960药敏结果为金标准,Xpert MTB/RIF、荧光PCR熔解曲线和基因芯片技术检测利福平耐药的敏感度分别为88.89%(16/18)、94.44%(17/18)、88.89%(16/18),特异度分别为96.21%(127/132)、96.21%(127/132)、95.45%(126/132)，三种检测方法的敏感度和特异度比较,差异均无统计学意义(P>0.05)[34]。与其他杂交技术相比较，基因芯片的特点是集成度更高，能够同时获得大量的信息。

3 基于基因测序技术的分子诊断

基因测序可获得完整和准确基因序列信息,被认为是基因检测和分子诊断的金标准。根据测序原理不同,可分为一代测序、二代测序技术及三代测序。一代测序技术的主要特点就是测序读长可达1000 bp，准确性高达99.999%，但它的通量低，成本高。目前一代测序在验证序列以及验证基因组组装完整性方面都是金标准。二代测序(Next-generation sequencing，NGS)又被称为高通量测序,具有测序速度快、敏感性好、分辨率高等特点，已被广泛应用于产前诊断、肿瘤和遗传性疾病诊断等领域,在感染性疾病的诊断和药敏分析领域也表现出良好的应用价值[35]。利用NGS技术，研究者对TB的病原学筛查、耐药基因检测及分枝杆菌菌种鉴定已经进行了大量的研究[36]，提高了TB、NTM的诊断效能及治疗效果。第三代测序技术是指单分子测序技术[37]，DNA测序时，不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序，三代测序具有更长的测序读长优势，对于TB等微生物测序而言数据更加保真,具有读取高质量基因序列能力[38]。在应用于TBM诊断中，4项研究(包含342个CSF样本)的Meta分析[39]显示，宏基因组测序(Metagenomic next-generation sequencing，mNGS)敏感性范围在27%～84%，平均61%，I2值92%，特异性范围在96%～100%，平均98%，I2值74%，ROC曲线下面积AUG=0.98。mNGS对TBM的诊断敏感性中等，特异性高，ROC曲线下面积表明诊断效果非常好。Xing等[40]一项前瞻性多中心研究表明，mNGS在病毒性脑膜炎中AUC：0.659，95%CI：0.566～0.751，敏感性为42.6%；在结核性脑膜炎中AUC：0.619，95% CI：0.516～0.721，敏感性为27.3%；在细菌性脑膜炎中AUC：0.846，95% CI：0.711～0.981，敏感性为73.3%；在隐球菌性脑膜炎和脑曲菌病敏感性分别为76.92%和80%，研究显示脑脊液mNGS检测能够有效识别引起传染性中枢神经系统疾病的病原体。mNGS、抗酸染色、常规 PCR和培养对TBM的诊断敏感性分别为 66.67%、33.33%、25%、8.33%[41]。基因组测序相对于其他技术对TBM的诊断更具有优势，且能够对不同的脑膜炎疾病进行鉴别诊断，高昂的测序成本使其不能够在临床中常规应用，但应用于疑难病例及危重症患者是一个不错的选择[42]。基因组测序的灵敏度较高，再无法保证CSF标本绝对清洁的前提下，结果分析也是需要生信专家及临床医生的综合分析。

4 基于核酸质谱技术的分子诊断

基于PCR反应的电喷雾核酸质谱(PCR coupled with electrospray ionization mass spectrometry，PCR-ESI-MS)是一种新技术，最近被用于从临床标本或培养后6 h后的标本中鉴定病原体，可用于评估耐多药结核病(MDR-TB)，以及鉴定分枝杆菌属。有研究[43]表明，以16S rRNA基因测序为标准，在对68株MTBC和97株NTM鉴定中，PCR-ESI-MS准确的鉴定了所有的MTBC分离株，对琼脂培养物和MGIT肉汤培养物鉴定到种水平的准确性分别为97.9%和95.8%。与琼脂比例法检测耐药性相比，PCR-ESI-MS鉴定MTB的敏感性和特异性分别为利福平100%和92.3%，异烟肼100%和93.8%，乙胺丁醇91.6%和94.4%，氟喹诺酮100%和100%。这种新技术是一种快速、准确的方法，在MTB的诊断中该方法优势明显，有限的CSF标本中获得菌种鉴定及耐药信息是临床治疗中迫切需求的，但其局限性在于劳动力成本过高、对专业人员的要求以及仪器成本过高，无法应用于小型临床微生物实验室。

5 基于游离DNA技术的分子诊断

循环游离DNA(Circulating cell-free DNA，cfDNA)是指从人体细胞或分枝杆菌(死亡或分泌等形式)释放出的DNA，主要存在于各种体液循环中，如血液、唾液、尿液、痰、脑脊液和组织等。cfMTB-DNA检测对胸膜结核的敏感性为50%～79.5%，对结核性脑膜炎诊断敏感性为56.5%～100%。且cfMTB-DNA 检测明显优于Xpert试验，Xpert试验显示灵敏度≤16.7%，特异性为100% (95%CI：89.7%～100%,P<0.001)。cfMTB-DNA qPCR检测是一种准确的分子检测，可以提供结核分枝杆菌病原学的直接证据，并有望提高结核分枝杆菌的诊断水平[44]。cfDNA在体内含量较少，无论qPCR技术或者测序技术，只有具有较高的检测深度，才能提高其在TBM检测中的诊断价值。

6 挑战与希望

TBM的临床表现多样性，以及脑脊液标本菌量少等特征，限制了当前诊断方法的效能，因此临床工作中早期准确诊断具有挑战性，虽然浓缩收集脑脊液方法在一定程度上提高了核酸扩增实验(Nucleic acid amplification test，NAAT)的敏感性，但临床中大量脑脊液标本收集存在一定困难，导致分子诊断敏感性不高，阴性结果不能排除TBM。Xpert和新一代Xpert Ultra在检测结核分枝杆菌及利福平耐药中得到了全球的认可，但越来越多的耐多药结核病例出现，单一药物耐药性检测同样存在不足。高分辨熔解曲线及其他分子杂交技术应用于TBM分子耐药性检测也受限于脑脊液标本中分枝杆菌量过少，无法提供高质量的且足量的核酸，检测药物较少。基因组测序技术虽然对中枢系统感染的诊断鉴别具有明显的优势，但其高昂的测序成本不能够常规应用到临床。

以上各类方法的局限性对下一代NAAT提出了新的要求，寄希望于敏感性更高的新技术的研发，提高对TBM的早期快速准确效能，减少误诊和漏诊，使得TBM患者能够得到早期规范的治疗，进一步降低致残率和病死率。