分子检测在甲状腺结节诊断中的研究进展

2021-01-09杨雅静汪耘吉冯尚勇

实用临床医药杂志 2021年2期

杨雅静, 汪耘吉, 冯尚勇

(1.大连医科大学第二临床学院, 辽宁大连, 116000; 2.江苏省苏北人民医院内分泌科, 江苏扬州, 225001)

甲状腺结节(TN)的诊断需要综合病史、临床表现、超声特征、穿刺细胞学、实验室检查及影像学表现等综合判断，其中超声引导下的甲状腺细针穿刺(US-FNA)是国内外TN诊治指南推荐的主要诊断方法之一，广泛应用于临床。但有研究[1-2]发现US-FNA存在约5%的假阳性率和5%的假阴性率，约30%的标本无法明确其病理性质。目前，已进入分子诊断及精准治疗时代，细针穿刺(FNA)标本相关的基因检测可准确对细胞学不确定的TN进行病理性质评估，提高诊断的准确率[3]。本文就几种常见的分子标志物对TN诊断及预后评估相关研究的进展进行综述。

1 基因突变和重排

1.1 BRAFV600E基因突变

B型RAF激酶属于RAF家族的丝氨酸/苏氨酸激酶，并且是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径最有效的激活剂，该蛋白在细胞增殖、分化和凋亡中具有重要作用。研究[4-5]表明约50%至80%的甲状腺乳头状癌(PTC)发生BRAFV600E突变，其被视为PTC特异性的分子标志物。BRAFV600E在其他类型的甲状腺癌，如甲状腺滤泡状癌(FTC)和Hürthle细胞癌，很少甚至不发生突变[6]。文献[7]表明BRAFV600E突变在PTC诊断中具有高度特异性，阳性突变可以避免细胞学诊断为不确定结节的两阶段手术(即诊断性腺叶切除术后的甲状腺全切除)，但其诊断灵敏度存在争议。一项荟萃[8-9]分析发现BRAFV600E突变对FNA诊断不确定组的诊断灵敏度仅有60%，对改善细胞学的诊断准确性无意义。但最近的一项研究[8-10]发现BRAFV600E突变联合FNA检查的灵敏度达98.4%, 准确率为98.1%。此外，相关研究表明BRAFV600E突变被视为PTC预后不良的标志物，与甲状腺癌的包膜浸润、淋巴结转移、TNM分期较高等不良结局密切相关，可作为PTC复发风险的预测因子。XING M等[11]通过纳入1 849名PTC患者分析BRAFV600E突变与PTC患者死亡率的相关性，结果表明带有BRAFV600E突变的PTC患者的死亡率更高。

尽管BRAFV600E突变在PTC中具有高度特异性，但是其诊断灵敏度存在争议，且仅与PTC关系密切，因此BRAFV600E突变分析应作为辅助手段与细胞学、影像学相结合，以明确TN性质[4, 8]。

1.2 RAS基因突变

RAS突变是FNA标本中检测到的另一常见突变类型，目前共发现HRAS、NRAS和KRAS三种亚型，RAS基因编码的GTP/GDP结合蛋白参与MAPK及phosphatidylinositol 3 kinase(PI3K)/protein kinase B(AKT)途径中的细胞内信号传导，在传递细胞生长分化信号方面起重要作用。该基因突变将导致RAS胞内信号过度活跃，细胞不可控制地增殖、恶变。报道[12-13]指出NRAS和HRAS突变预测甲状腺肿瘤具有更高的阳性预测值(PPV), 并且与KRAS突变相比，其滤泡变异型甲状腺乳头状癌(FVPTC)的关系更为密切。KRAS突变与嗜酸性细胞病变相关，发生此突变的结节恶性率更低。

GUAN H等[14]通过观察仅RAS突变的恶性结节12例患者，发现其均无腺外扩散、淋巴结及血管浸润或远处转移，且术后随访期间也无复发，证明RAS突变可作为甲状腺癌的预后指标，提示低风险癌。一项随访时间为8.3年的研究[15]表明所有携带RAS突变的细胞学良性结节均表现为惰性生长。美国甲状腺学会建议，对于RAS突变阳性的结节行腺叶切除术。RAS突变多见于滤泡型肿瘤，包括滤泡型腺瘤(FTA)、FTC以及 FVPTC等。目前尚不清楚RAS突变阳性的细胞学良性结节是否有癌变的可能。最近一项荟萃分析[16]显示, RAS突变在被细胞学诊断为不确定结节的恶性肿瘤中有高达93.5%的特异性，但敏感性仅为34.3%, PPV为78.0%。因此单一检测RAS突变作为甲状腺恶性肿瘤的预测指标意义不大，研究指出RAS突变与其他遗传标记物的结合具有更高的PPV。

1.3 RET基因突变

RET原癌基因负责编码属于一种受体酪氨酸激酶的跨膜蛋白，参与的信号通路包括丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)通路，与细胞生存、增殖密切相关。当RET基因发生突变或重排，激活RET基因，并可能编码出具有异常活动的RET蛋白，导致细胞出现异常生长、侵袭和转移等，进而导致肿瘤的发生与进展。早期有报道提出RET/PTC重排是PTC中发现的最常见遗传改变，是其特有的标记物。RET重排至少有13种, 90%以上的重新排列是RET/PTC1和RET/PTC3。相关研究[17-18]报道显示，不同类型的RET/PTC可能与PTC的不同临床病理特征有关，RET/PTC1在典型的PTC或微小乳头状癌中更常见且预后更佳; 而RET/PTC3则与侵袭性肿瘤的关系更密切，与淋巴结转移呈正相关，在儿童或暴露于电离辐射的PTC患者中发生更频繁。但有研究[19]对RET/PTC重排是PTC的特异性遗传改变提出质疑，指出RET/PTC重排也发生在滤泡性腺瘤和桥本氏甲状腺炎等非恶性肿瘤性结节中。RET点突变可导致甲状腺滤泡细胞恶变，其是遗传型甲状腺髓样癌(MTC)的发病基础，可在98.3%的遗传型MTC和6.2%的散发型MTC中发现RET突变, RET点突变对于MTC筛查具有重要的参考价值，对于携带该突变的人群，应进行密切随访或预防性手术治疗[20，21]。WANG S等[22]提出RET点突变与MTC淋巴结转移呈正相关，且为MTC靶向分子治疗提供了强有力的依据。

由于检测方法、地域差异、辐射暴露史及肿瘤的组织亚型不同, PTC中RET/PTC重排的发生率差异很大，且RET/PTC重排在良性结节中也可见。因此，对FNA标本单独行RET/PTC重排的诊断性检测并不可靠。

1.4 PAX8/PPARγ重排

PAX8/PPARγ重排是指PAX8编码区2q13断裂点与 PPARγ 编码区 3q13 断裂处融合形成。该种染色体易位将导致具体致癌机制尚未明确的致癌性PAX8/PPARγ融合蛋白(PPFP)产生。PAX8/PPARγ重排最初发现于FTC和FTA患者中，被认为是FTC中最常见的融合基因[23]。有研究[23-25]显示，在FTC中，PAX8/PPARγ重排的阳性表达率在30%～63%, 在FTA中可达55%, 尚未在良性或恶性的嗜酸性细胞瘤中检测到此类重排的表达[25]。ARMSTRONG M J等[25-27]提出在PTC患者中也能检测出PAX8/PPARγ重排，但大都归类于FVPTC, 与FTC的组织病理学和生物学特性相似，好发于青年人，肿瘤的体积小，伴血管浸润，但是其组织分化及预后良好，无淋巴结累及和向甲状腺周围组织浸润倾向。有研究[23]发现PAX8/PPARγ重排在FTA中的表达明显低于FTC，这种突变可高度提示发生高分化的甲状腺癌，有助于FNA标本的滤泡性癌与滤泡性腺瘤(良性)的鉴别诊断，有利于避免良性结节行手术及恶性肿瘤漏诊的发生，并减少患者负担。

1.5 P53基因突变

P53基因是实体肿瘤的一种抑制基因，研究[28]证明在近半数的恶性肿瘤中该基因发生突变。DWIVEDI S S等[28]发现恶性TN中P53基因突变检出率(85.29%)显著高于良性结节(29.35%), 其诊断良恶性结节的准确率达76.88%。现有文献[29]发现P53基因突变在甲状腺未分化癌的检出率高达50%～80%, 而在PTC和FTC的检出率分别为40%和22%, 且主要发生在PTC和FTC更具侵袭性的组织学亚型中，P53基因突变与甲状腺肿瘤的去分化密切相关。ZHANG J等[30]对50例甲状腺滤泡性肿瘤进行分子检测，发现P53基因突变与癌症淋巴结转移有关，并提出其为甲状腺癌预后不良的指标。P53基因突变为低分化甲状腺癌等肿瘤相关的靶向治疗提供了新方向。

1.6 TERT启动子突变

端粒酶逆转录酶(TERT)是端粒酶的催化亚基，可通过在染色体的末端加上端粒，对保持染色体长度和基因序列的稳定性起重要作用。端粒酶活化是肿瘤形成的关键，当TERT启动子发生突变时，激活端粒酶进而导致细胞癌变。研究[31-32]发现TERT启动子突变存在于各种甲状腺癌中，甲状腺未分化癌等高侵袭性肿瘤的基因表达率更高，而甲状腺正常组织及良性甲状腺肿瘤通常罕见表达。研究[32-33]表明TERT突变与患者发病年龄较大、甲状腺癌的腺外侵犯、血管侵袭、远处转移及TNM分期升高显著有关，该基因突变有望成为甲状腺癌的诊断及预后指标。

1.7 TERT与其他基因突变共存

研究[34-35]表明, TERT启动子突变与BRAFV600E突变对甲状腺癌的不良预后有协同效应，同时携带2种突变的患者复发率及死亡率显著上升，其肿瘤侵袭性相比任意单独基因突变的患者更高。此外，报道[32]显示TERT启动子突变率与BRAFV600E突变率呈相互促进关系。有研究[36]阐明了协同作用的机制: 一方面，机体存在BRAFV600E突变时，通过激活MAPK途径并上调ETS转录因子，与TERT启动子突变产生的ETS结合位点结合，增加TERT的表达和端粒酶活性; 另一方面, TERT启动子突变可进一步激活与炎症、癌变等相关的分子通路。与BRAFV600E作用相似，RAS突变通过优先激活PI3K/AKT信号通路，与TERT启动子突变共存时，协同作用甲状腺癌的预后，导致肿瘤的侵袭性增高。因此，对TN进行TERT突变联合BRAFV600E突变或RAS突变检测，具有较高的预后评估价值。

2 基因表达检测方法

2.1 多分子联合检测

尽管单个遗传标志物具有较高的特异性，但其敏感性低，限制了单个基因标志物检测在细胞学不确定TN的临床应用。研究表明多个基因标记物组合诊断将显著提高诊断准确率。在分化型甲状腺癌中最常见的基因包括: BRAF, NRAS, HRAS, KRAS, RET/PTC1, RET/PTC3和PAX8/PPARγ。一项前瞻性研究[3]表明多基因检测在细胞学诊断不确定的结节中有87%～95%的高阳性预测值，并提出可有助于医生选择准确的手术方式，对于该组合中的任何基因阳性突变应行甲状腺全切除术。

2.2 Afirma基因表达分类器

Afirma基因表达分类器(GEC)是一种通过检测167个基因转录物的表达来诊断TN性质的检测方法。相关荟萃分析[37]显示，GEC的总敏感性为95.5%, 特异性为22.1%, 阴性预测值(NPV)为88.2%, PPV为44.3%, 由于其具有高度的敏感性及NPV，认为其属于一种“排除性方法”，可以高效的从不确定的TN中识别出良性结节，从而降低医疗成本。一项研究[37]通过总结GEC检测后的术后病理结果指出，大多数在手术后具有良性病理结果的是滤泡性腺瘤(31.2%), 良性滤泡性结节(15.6%)和腺瘤样结节(13.0%), 并提出必须结合其他分子标记物来提高检测GEC的特异性。GEC检测主要局限于其特异性低，且检测为良性的结节缺乏长期随访评估和组织病理学诊断，因此其特异性与预测值相比会降低，敏感性会增高[38-39]。另外一个局限性在于嗜酸性细胞肿瘤的恶性风险相对较低，但大多数均呈GEC阳性，导致GEC检测的假阳性增加[40]。

2.3 二代测序

二代测序(NGS)的发展，阐明了甲状腺癌的分子发病机制，且仅需极少量的核酸就能同时在大型基因组中进行多基因突变的靶向检测，该技术对现有基因突变组合进行了扩展(包括其他基因突变、融合和易位，以及microRNA基因表达组)。

NIKIFOROVA M N等[41]基于NGS提出对甲状腺恶性肿瘤诊断密切有关的12种基因的284个突变位点进行检测，发现145个恶性肿瘤中有110个发生突变, 83个良性结节中仅有5个检测出突变，表明NGS具有高度敏感性和诊断准确性。NIKIFOROV Y E等[42]开发了ThyroSeqV2，能同时检测甲状腺癌中13种基因的点突变和42种基因融合，具有90%的敏感性和95%的特异性, PPV和NPV分别为83%和96%, 证明ThyroSeqV2能同时具有较高NPV和PPV，不仅检测效果较优，还能帮助有高风险的恶性结节患者选择适当的手术。一项回顾性研究[43]指出，ThyroSeqV2的PPV在各项研究中差异很大。最近的ThyroSeqV3研究表明其可检测112个与广泛的恶性肿瘤(包括Hürthle细胞癌)有关的各种基因的点突变、基因融合、拷贝数改变及基因表达改变。一项多中心前瞻性研究[44]显示ThyroSeqV3的敏感性为94%, 特异性为82%, PPV和NPV分别为66%和97%，可避免高达61%的不确定结节患者过度治疗，并提供阳性结节的分子特征，帮助临床进一步给予个体化治疗。