淋巴细胞亚群在鼻咽癌高癌家系外周血中的临床意义

兰炎根, 陈舒华, 李嘉, 黎雄文, 邓晔

全世界约80%的鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)发生于我国,特别是广东、广西等地,好发于各年龄段[1-3]。NPC还表现为家族聚集现象,具有NPC发病家族史的人发生NPC的概率较高,且遗传因素在黄种人和白种人中均表现明显,特别NPC患者的一级亲属(包括患者父母,同胞兄妹及子女)表现更明显[4-7]。外周血淋巴细胞亚群在病毒感染、自身免疫性疾病、免疫缺陷性疾病、变态反应性疾病、再生障碍性贫血、胃癌中都有异常改变,通过对TBNK淋巴细胞亚群分析,可以了解细胞免疫状态,进而对临床诊治提供一定依据[8-9]。S100-A9在食管癌、膀胱癌、胃癌等细胞运动、分化及转移等中发挥着重要作用。目前，淋巴细胞亚群在NPC高癌家系外周血中的临床意义研究报道较少。本研究对我院NPC高癌家系NPC患者外周血淋巴细胞亚群与S100-A9进行了检测和分析,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 以2016年1月至2019年3月梅州市人民医院门诊收治的60例高癌家系NPC患者为A组,NPC高癌家系中成员68人为B组,同期在我院进行体检的健康人员70人为C组。A组男48例,女12例;年龄28～52岁,平均(47.32±9.86)岁;A组患者均经病理活检确诊为NPC且其家族中已有至少2个一级亲属确诊为鼻咽癌,即该组患者均为NPC高癌家系NPC患者,所有患者在接受检查前未进行化疗、放疗等肿瘤治疗。B组男52人,女16人;年龄15～78岁,平均(42.61±8.76)岁,均为高癌家系NPC一级亲属,但未发生NPC。C组男54人,女16人;年龄28～54岁,平均(48.73±9.24)岁。3组受验者均已签署知情同意书，基本资料差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究获得梅州市人民医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法 采集3组受验者静脉血液标本2管,1管使用Ficoll分层液(北京索莱宝科技有限公司,产品货号: P8900)法分离各组外周血单核细胞后,采用流式检测分析TBNK细胞亚群，并动态观察;1管在无菌条件下以同样方法分离淋巴细胞,再分别抽提细胞总蛋白,保证标本无污染,处理后立即入液氮中保存备用。抽提出蛋白质,应用Western-blot方法对钙调蛋白S100-A9进行验证分析。对比3组淋巴细胞亚群与S100-A9含量,并分析其意义。

Ficoll分层液法:采集患者血液后,加入放有肝素液的无菌试管内,然后加入等量的生理盐水稀释;将稀释后的血液加入人淋巴细胞分离专用插管,在水平离心机中离心25 min,液体从上向下分别为血清层、白膜层、淋巴液层、红细胞层,取出白膜层即是我们需要的外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。

流式分析:使用无菌生理盐水清洗分离后的PBMC,分别使用流式专用TBNK细胞抗体(上海艾博抗体有限公司)在4 ℃冰箱孵育30 min,无菌生理盐水再次清洗,并设立对照(分离后的PBMC,但不加TBNK抗体)。使用流式检测仪进行分析。

Western-blot法:提取PBMC中蛋白;使用SDS-PDAG电泳凝胶跑样;将样品条带转至NC膜上;孵育一抗4 ℃过夜;孵育二抗室温下2 h;PBS清洗后,发光显示蛋白条带。

2 结果

2.1 外周血TBNK细胞含量对比 A组患者外周血中CD3+(T)细胞、CD4+(T)细胞、CD19+(B)细胞、CD56+(NK)细胞明显低于B组和C组,而CD8+(T)细胞明显高于B组和C组;B组受验者外周血中CD3+、CD4+、CD19+、CD56+细胞明显低于C组,而CD8+明显高于C组,差异均有统计学意义(均P<0.05)，见表1。

表1 3组受验者外周血TBNK细胞含量对比

2.2 外周血S100-A9对比 Western Bloting检测显示A组S100-A9蛋白表达量明显高于B组和C组;B组患者S100-A9蛋白表达量明显高于C组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。

2.3 A组患者治疗前后外周血淋巴细胞及S100-A9对比 A组患者经过治疗后,患者外周血中CD3+、CD4+、CD19+、CD56+细胞明显高于治疗前,而CD8+明显低于治疗前(见表2);A组患者S100-A9蛋白表达量明显低于治疗前，差异均有统计学意义(均P<0.05)。

表2 A组患者治疗前后外周血淋巴细胞对比

3 讨论

鼻咽癌发病表现出明显的家族聚集现象,中山医科大学肿瘤医院分析了1 142例鼻咽癌患者的病例资料,高达21.9%的患者具有肿瘤家族史[8];Albeck等[9]报道1980—1990年之间格林兰岛上的爱斯基摩人有48人被诊断为鼻咽癌,其中7例具有鼻咽癌家族史,发生率14.6%;凌启南等[10]报道1 163例鼻咽癌家族史调查结果,发现93例鼻咽癌有高癌家系,发生率为8.0%;有报道显示，375例鼻咽癌中25例具有鼻咽癌家族史,发生率为6.61%[11];Levine等[12]还报道了一些白种人的鼻咽癌高癌家系,同时其发现了17例发生于非中国人的其他国家及种族的病例,虽然他未能统计出其发生率,但根据其他种族的发病率,足以表明遗传因素在各个种族的鼻咽癌发病上都具有不可忽视的作用。根据我们的研究资料并结合文献可知，鼻咽癌高癌家系的发生率大概占总鼻咽癌发病数的7.7%，因此,早发现、早诊断对鼻咽癌高癌家系患者的治疗和预后具有深远的意义。外周血淋巴细胞(T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞亚群、NK淋巴细胞亚群)是检测机体免疫功能的重要指标,对疾病的早期诊断和治疗具有重要意义[13-14]。S100-A9蛋白是以细胞内钙离子浓度变化为中介信号,进而对钙离子结合蛋白起到激动和移植的作用,它可能在NPC家系NPC发生过程中具有重要作用[15]。

本研究检测外周血中TBNK细胞水平及S100-A9含量,结果发现,A组患者免疫功能明显低于B组和C组,B组受验者免疫功能明显低于C组,说明NPC患者的免疫功能较低,对其TBNK细胞水平进行检测可能有助于对患者病情的早期诊断。A组患者S100-A9水平明显高于B组和C组受验者,B组受验者S100-A9水平明显高于C组,说明S100-A9水平与是否会发生NPC具有一定的相关性。本研究鉴于其他疾病中外周血淋巴细胞亚群与S100-A9水平较高,提出这一现象可能在NPC患者中也存在,具有一定的创新性,能给临床提供一定的依据。但由于样本量较小,技术水平等限制,研究结果在数据方面可能存在一些偏差,研究深度也需进一步加强。

综上所述,检测外周血TBNK细胞及S100-A9蛋白水平能够区分NPC高癌家系患者、NPC高癌家系成员及正常人群；高癌家系NPC患者治疗后TBNK细胞及S100-A9蛋白水平变化明显,可作为NPC风险预测和治疗效果评估的指标。