Ssc-miR-133a-5p的靶基因预测及其相关信号通路的生物信息学分析

常雪蕊 ，赵志显 ，赵俊金 ，邓晓彬 ，刘 刚 ，张永红 ，郭 勇 ，倪和民 ，王楚端 ，邢 凯 ＊

（1.北京农学院动物科学技术学院，北京 102206；2.全国畜牧总站，北京 100193；3.北京田园奥瑞生物科技有限公司，北京100096；4.中国农业大学动物科学技术学院，北京 100194）

脂肪是机体能量贮存最主要的形式，脂类代谢在机体生命活动中发挥着至关重要的作用，而脂肪的代谢对于畜牧生产有重要意义。在畜禽生产中，脂肪对于维持生命活动、生长发育和生产是至关重要的。近年来，研究者以猪为试验对象进行了大量miRNA（小的非编码单链RNA）的研究，研究表明，miRNA参与调控脂肪细胞的分化、脂肪形成、脂肪酸代谢、胆固醇合成等多个生命过程[1,2]。目前有关调控猪脂肪代谢相关的miRNA研究十分欠缺。

许多miRNA已成为脂质代谢和胆固醇代谢的重要调节因子。例如，已经有研究确定了miR-33的功能，包括调节巨噬细胞激活和线粒体代谢猪脂肪发育相关。将miR-33识别为一种重要的非编码RNA，可独立于其在调节脂质代谢中的作用而控制心血管稳态[3]。例如miR-148a和miR-128-1，是靶向调节细胞胆固醇代谢的重要蛋白质，并有望治疗动脉粥样硬化在内的心脏代谢疾病[4]。

在猪的脂肪合成中，有实验证明miR-146a-5p能够抑制脂肪生成[5]。有研究发现miR-196a/b（miR-196a，miR-196b-5p）在皖南花猪中的表达水平最高，miR-196a/b通过一种新的途径影响猪背长肌中的脂肪发生脂肪细胞因子信号通路[6]。

目前，关于miR-133a的报道多集中影响细胞的增殖和分化，研究用于抑制癌症疾病的细胞增殖。例如下调miR-133a-3p对膀胱癌的肿瘤起抑制作用[7]，miR-133a-5p会抑制成肌细胞的增殖和分化等[8]。研究利用了生物信息学分析技术，预测miR-133a-5p的靶基因，并对其靶基因集合进行蛋白质互作网络分析、KEGG通路富集分析，为ssc-miR-133a-5p的深入研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 保守性分析

从miRbase（www.miRbase.org）中检索到成熟的miR-133a-5p候选序列，然后选择人、小鼠、鲤鱼、鸡等多个物种与猪（ssc）miRNA序列进行相似性分析。

1.2 ssc-miR-133a-5p靶基因预测

使用Targetscan（http://www.targetscan.org/vert_72/）、miRDB（http://mirdb.org/）和miRWalk（http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）三种在线软件进行miR-133a-5p靶基因预测，并取3种结果的交集用于进一步分析。使用Venny（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）对3种软件预测的靶基因进行可视化分析。

1.3 靶基因的生物信息学分析

使用STRING（https://string-db.org/）功能性蛋白质互作网络在线分析软件，对候选靶基因进行蛋白质互作分析。使用DAVID（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）生物信息功能分析软件，对候选靶基因进行KEGG通路分析。通过超几何分析检验法进行统计学分析，利用Benjamini-Hochberg 算法进行校正，显著富集Pathways的阈值为BenjaminiP-value＜0.05KEGG通路。

1.4 脂肪沉积相关的关键靶基因筛选

在课题组的前期研究中，利用转录组测序筛选出的肥胖组与瘦组长白猪脂肪组织中差异表达基因564个。为了进一步筛选ssc-miR-133a-5p调控脂肪沉积相关的靶基因，预测的靶基因与差异表达基因取交集。与ssc-miR-133a-5p表达趋势相反的靶基因表示二者可能存在重要的反向调控关系。

2 结果

通过对不同物种的microRNA-133a-5p的序列相似性分析（表1），人与猪的序列完全相同，所以在线预测全部选用has-133a-5p。

通过miRWalk在线预测，获得了has-133a-5p的5657个候选靶基因；通过TargetScan在线预测，获得了has-miR-133a-5p的3353个候选靶基因；通过miRDB在线预测，获得了has-133a-5p的496个候选靶基因；候选靶基因有239个在3个预测结果中重叠出现（图1）。

在预测得到的239个候选靶基因存在蛋白质互作关系（图2）。并得到了靶基因所参与到的KEGG信号通路结果（图3）。

对关键靶基因鉴定。将预测的靶基因与在同样样本中差异表达的基因取交集，发现6个基因MAPK6、RORA、TMEM182、POPDC2、PPARGC1A和FXR1同时出现在两组中。这6个基因的表达水平与ssc-miR-133a-5p的表达水平呈相反的趋势。通过比较分析得表2。

表1 不同物种间序列相似性分析

3 讨论与分析

随着测序技术的发展，高通量测序技术在全基因组范围内鉴定功能miRNA发挥了重要的作用。在课题组前期的研究中，针对具有显著背膘厚度差异的长白猪进行了脂肪组织miRNAome测序[9]，结果显示ssc-miR-133a-5p在肥胖组猪脂肪组织中的表达水平显著高于瘦组。这预示着ssc-miR-133a-5p可能在脂肪沉积的过程中发挥着重要的作用。

MiRNA在生命活动的各个方面都起着重要的作用，如生长发育、细胞分化及凋亡、能量代谢和多种疾病的发生等。通过KEGG信号通路分析，ssc-miR-133a-5p也涉及胰岛素分泌、AMPK等的信号通路。胰岛素是一种有效的营养物质分解代谢协调器，在脂肪细胞中尤其如此，胰岛素在脂肪细胞发育过程中以剂量依赖性方式决定脂质的积聚，胰岛素信号在猪脂肪细胞分化中起着基础作用[10]。另外，猪脂肪组织合成并分泌许多直接或间接影响胰岛素作用的脂肪因子（瘦素，脂联素等）[11]。AMPK在猪的代偿性生长中起着重要的作用。AMP激活的蛋白激酶（AMPK）在调节细胞能量平衡中起主要作用[12]。此外，AMPK信号通路的激活在减少猪的肌内脂肪沉积中起积极作用[13]。通过得到靶基因显著富集分析显示，ssc-miR-133a-5p参与类固醇激素介导的信号通路、维持细胞葡萄糖稳态、蛋白质合成等多种功能。

表2 预测靶基因与样本差异表达基因分析

在ssc-miR-133a-5p的候选靶基因中，与在同样样本中差异表达的6个基因都已经有大量实验证明发现其在能量代谢中发挥重要作用。研究表明，TMEM182参与白色脂肪组织的转录和表达极为突出，并且在体外成脂和成肌过程中，TMEM182转录物的急剧上调提示TMEM182可能在重要的脂肪细胞内起作用[14]。实验表明，肝脏RORA参与调节脂质体内平衡，介导肝脂质代谢。当进行高脂肪含量饮食测试时，肝脏特异性RORA缺陷型小鼠会发展为肝脂肪变性，肥胖和胰岛素抵抗。全局转录组分析显示，RORA的肝脏特异性缺失会导致增加肝糖和脂质代谢[15]。大量研究证明了参与调节脂肪生成和脂质代谢的基因的表达可能影响猪的经济重要脂肪性状，PPARGC1A在波兰大白猪，波兰长白猪和皮特兰猪的脂肪沉积中等位基因特异性差异极显著，PPARGC1A在猪脂肪组织中受到顺式调节[16]。BMP6抑制葡萄糖的产生，颉颃糖原分解作用，从而调节糖代谢[17]。支链氨基酸（缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸）的补充通常有益于能量消耗，循环中支链氨基酸水平的升高与肥胖和糖尿病有关。棕色脂肪组织中的支链氨基酸的主动分解代谢是由SLC25A44介导的，它将支链氨基酸转运到线粒体中。棕色脂肪组织是通过SLC25A44控制支链氨基酸分解代谢的关键[18]。

综上所述，ssc-miR-133a-5p可能通过调控TMEM182、RORA、PPARGC1A等基因，进而参与细胞内营养物质的代谢，调节能量平衡，以及参与AMPK等信号通路发挥重要调控作用。这些发现将有力支持ssc-miR-133a-5p参与猪的脂肪沉积调控机制的探索。

4 结论

Ssc-miR-133a-5p候选靶基因RORA与PPARGC1A等存在蛋白互作关系。TMEM182、BMP6、SLC25A44等多个候选靶基因参与葡萄糖和脂肪代谢平衡、脂肪沉积等，可能通过胰岛素的分泌及昼夜节律、AMPK等信号通路影响猪的脂肪生成调控机制。