双葛止泻口服液对小鼠的抗炎止泻药效学研究

2021-01-09桑卡娜李召斌晏磊杨绒娟高艳艳周德刚

中国动物保健 2020年11期

桑卡娜，李召斌，晏磊，杨绒娟，高艳艳，周德刚

（国家兽用药品工程技术研究中心/ 洛阳惠中兽药有限公司河南洛阳 471003）

双葛止泻口服液是由洛阳惠中兽药有限公司、普莱柯生物工程股份有限公司和河南新正好生物工程有限公司联合研制的三类新兽药。双葛止泻口服液由金银花、葛根、黄芩、黄连、白芍和炙甘草组成，来源于《伤寒论》中的“葛根芩连汤”。双葛止泻口服液方中金银花清热解毒，凉血止泻，葛根止泻生津，鼓舞胃气，二者共为君药，具有解热、抗炎、抗病毒等药理作用[1,2]；以苦寒之黄连、黄芩为臣，清热燥湿，厚肠止泻；白芍养血合营，缓急止痛为佐药；炙甘草调和药性，合白芍酸甘化阴，缓急止痛。全方配伍，共奏清热解毒，止泻生津之功。文献报道葛根芩连汤对感染性腹泻具有一定的治疗作用[3,4]。为了研究双葛止泻口服液的药理作用，考察其对小鼠抗炎止泻效果，本研究采用二甲苯致小鼠耳肿胀模型，来研究抗炎作用，采用番泻叶腹泻模型和墨汁推进法来探讨双葛止泻口服液止泻作用，为其临床应用提供理论依据。

1 试验材料

1.1 试验动物

4 周龄健康BALB/c 小鼠50 只，雄性，SPF 级，许可证号：SCXK（京）2016—0011，4 周龄健康BALB/c 小鼠130 只，雌雄各半，SPF级，许可证号：SCXK（京）2016—0011，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。于普莱柯生物工程股份有限公司经河南省试验动物协会认证通过的SPF 小鼠应用合格的动物房内观察3d 无异常进行试验，使用小鼠IVC 独立送风隔离笼具。饲养条件：灭菌全价饲料喂养，自由采食与饮水，室温20～24℃，相对湿度40%～60%。

1.2 试验药品

双葛止泻口服液，规格：每1mL相当于原生药0.45g，批号：20170201，洛阳惠中兽药有限公司；

杨树花口服液，规格：每1mL 相当于原生药1g，批号：16092002，郑州后羿制药有限公司。

1.3 试验仪器及试剂

YLS-Q4 型耳肿打耳器，上海艾研生物科技有限公司；AB265-S型电子分析天平，梅特勒托利多仪器有限公司；Milli-Q 型（超）纯水机，美国Millip ore 公司；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器、RE-2000B旋转蒸发仪、SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵，巩义予华仪器有限公司；JA2003 电子天平，上海上平仪器有限公司。

二甲苯，批号：20080419，派尼化学试剂厂；番泻叶，批号：150701，购自河南百信药房；6 号灌胃针；一次性使用无菌注射器；滤纸；钢尺；碳素墨汁；计时器；解剖剪等。

2 试验方法

2.1 双葛止泻口服液对小鼠耳肿胀抗炎作用研究

2.1.1 分组和给药方法取健康小鼠50 只，随机分为5 组，每组10 只，分别为双葛止泻口服液低（2.78mL/kg·d-1）、中（5.56mL/kg·d-1）、高（11.12mL/kg·d-1）剂量组，杨树花口服液对照组（3.15mL/kg·d-1）和模型对照组。4 个给药组均按0.1mL/10g灌胃给药，2 次/d，给药间隔6h，连续给药3d，模型对照组灌服蒸馏水。末次给药30min 后，于小鼠右耳正反两面分别用10μL移液器滴10μL二甲苯，左耳不涂作为对照，1h 后颈椎脱臼处死小鼠，用直径8mm 打孔器打下左右耳，称重，左耳做对照，以左右耳片重量差作为肿胀度，计算肿胀抑制率。

2.1.2 评价标准以模型对照组小鼠左右耳作为对照，构建小鼠耳肿胀模型，当模型对照组左右耳重差异显著或极显著时（P<0.05或P<0.01），表明模型构建成功。肿胀度=致炎耳片重（右耳）－非致炎耳片重（左耳）。肿胀抑制率（%）=（模型组肿胀度－给药组肿胀度）/ 模型组肿胀度×100。

给药组与模型对照组比较，肿胀度统计学差异显著或极显著时（P<0.05 或P<0.01），表明双葛止泻口服液对二甲苯所致的小鼠耳肿胀具有抑制作用。

2.2 双葛止泻口服液对番泻叶所致腹泻小鼠止泻作用研究

2.2.1 番泻叶制备取番泻叶125g，加10 倍量水煮沸10min，过滤，滤液减压浓缩成200mL，即浓度为0.625g/mL，4℃冰箱保存，用时水浴加温至25℃[6-9]。

2.2.2 分组和给药方法取健康小鼠60 只，随机分为6 组，每组10 只，雌雄各半。6 个组分别为双葛止泻口服液低（2.78mL/kg·d-1）、中（5.56mL/kg·d-1）、高（11.12mL/kg·d-1）剂量组、杨树花口服液对照组（3.15mL/kg·d-1）、模型对照组和空白对照组。0.1mL/10g 灌服给药，2 次/d，给药间隔6h，连续给药3d；模型对照组和空白对照组灌服同体积蒸馏水。末次灌胃给药前禁食12h，自由饮水。末次灌胃给药0.5h 后，除空白对照组灌服0.5mL蒸馏水外，其他各组小鼠灌服番泻叶提取液0.5mL/ 只。灌服番泻叶提取液后每只小鼠单独放一鼠笼中，笼底部放滤纸，每隔2h 换垫纸，观察各组小鼠的一般临床症状和腹泻情况，统计出0～2h、2～4h、4～6h 和0～6h每只小鼠的稀便率和稀便级，并计算各组小鼠的腹泻指数。

2.2.3 评价标准①稀便率：稀便率=每只动物的稀便次数/ 每只动物大便的总次数（稀便以滤纸上有污迹为标准）；粪便次数以每粒或每堆（不能分清粒数者）为1 次。②稀便级：表示稀便的程度，以稀便污染滤纸形成污迹面积的大小定级。分为4 级，标准如下：1 级：污迹直径<1c m；2 级：污迹直径1～1.9c m；3 级：污迹直径2～3c m；4 级：污迹直径>3c m。先逐个统计每一堆稀便的级数，然后将该鼠所有稀便级数相加除以稀便次数得稀便的平均级数，即为稀便级。污迹直径的测量方法：粪便形状为圆形，则直接量直径；若粪便形状为椭圆形则测量最长和近似圆的直径，相加除2。③腹泻指数：腹泻指数=稀便率×平均稀便级。

2.3 双葛止泻口服液对小鼠肠运动影响试验

取健康小鼠50 只，随机分为5 组，每组10 只，分别为双葛止泻口服液低（2.78mL/kg·d-1）、中（5.56mL/kg·d-1）、高（11.12mL/kg·d-1）剂量组，杨树花口服液对照组（3.15mL/kg·d-1）和模型对照组。按0.1mL/10g 灌胃给药，2 次/d，给药间隔6h，连续给药3d；空白对照组按0.1mL/10g 灌服蒸馏水。末次灌胃给药前禁食12h，自由饮水，末次灌胃给药0.5h后，各组小鼠均按照0.2mL/ 只灌胃给予10%碳素墨汁，20min 后用颈椎脱臼法将小鼠处死，将消化管自幽门至直肠末端完整地摘出，用直尺测量小肠全长及幽门至墨汁前沿的距离，记录试验中每只小鼠的小肠全长（c m）和墨汁移动距离（c m），并计算墨汁推进率。

墨汁推进率（%）=墨汁移动距离（c m）/ 小肠全长（c m）×100%

2.4 数据处理

所得数据用SPSS 19.0 统计软件进行处理。结果用均值±标准差表示。统计方法采用单因素方法分析，显著性用P 值表示，其中P<0.01 表示差异极显著，P<0.05 表示差异显著，P>0.05 表示无显著性差异。

3 结果

3.1 双葛止泻口服液对小鼠耳肿胀抗炎作用研究

各组小鼠右耳进行二甲苯致炎后，右耳均出现不同程度的红肿。左耳耳重12.80±0.57（mg），右耳耳重21.24±3.11（mg），且右耳重极显著高于左耳（P<0.01），表明本试验采用的小鼠二甲苯致炎模型成功，可以用于抗炎作用研究。

双葛止泻口服液对二甲苯所致的小鼠耳肿胀的影响试验结果如下表1。

表1 双葛止泻口服液对二甲苯所致的小鼠耳肿胀的影响（D,n=10）

注：上标无相同小写字母表示差异显著（P<0.05），上标无相同大写字母表示差异极显著（P<0.01）。

由表1 结果可知，双葛止泻口服液组中、高剂量组和杨树花口服液对照组小鼠耳廓肿胀度明显低于模型对照组，红肿程度有所减轻，且肿胀抑制率差异极显著（P<0.01），表明双葛止泻口服液具有抗炎作用，且双葛止泻口服液的剂量越大，肿胀度越小，抗炎作用越强。

3.2 双葛止泻口服液对番泻叶所致腹泻小鼠止泻作用研究

所有灌服番泻叶提取液小鼠在灌服0.5h 后均开始出现精神沉郁、背毛逆立；卧地不动、缩头、腹部剧烈抽动；个别小鼠闭眼、眼内有少量分泌物等临床症状。灌服番泻叶1h 后，均出现稀便，4～6h 时部分小鼠稀便消失，精神恢复，行为活跃。6h 后所有小鼠均未见稀便，精神、粪便恢复正常。

利用SPSS19.0 统计各组在灌服番泻叶后腹泻指数的差异，具体结果见表2。

表2 给药3d 后灌服番泻叶腹泻指数统计分析（D,n=10）

注：同一列中，肩标无相同小写字母者，为差异显著（P<0.05）；同一列中，肩标无相同大写字母者，为差异极显著（P<0.01）。

由表2 统计结果可知，上表4 个时间段内，空白对照组与模型对照组相比腹泻指数均有极显著差异（P<0.01）；临床观察结果可知所有灌服番泻叶提取液小鼠均出现不同程度的精神沉郁和拉稀等症状，而空白对照组无拉稀，粪便均正常，表明小鼠的番泻叶腹泻模型构建成功。0～6h 的统计结果可知，模型对照组与双葛止泻口服液低、中、高剂量组和杨树花对照药组比差异均极显著（P<0.01）。

3.3 双葛止泻口服液对小鼠肠运动影响试验

小鼠灌胃给药后，双葛止泻口服液低剂量组小鼠肠道的推进率小于空白对照组，但差异不显著（P>0.05），表明双葛止泻口服液低剂量不能有效的抑制肠推进。双葛止泻口服液中、高剂量组、杨树花口服液对照组肠道的推进率均显著低（P<0.05）于空白对照组，表明双葛止泻口服液中、高剂量组和杨树花口服液对照组均能有效的抑制肠道蠕动，降低小肠推进率。统计结果见下表3 所示。

表3 双葛止泻口服液对小鼠的肠推进影响（D,n=10）

4 讨论

4.1 小鼠耳肿胀抗炎作用研究

二甲苯致小鼠耳肿胀模型是急性非特异性炎症模型，是评价抗炎药物常见的方法，一般全部选择雄性动物，以防雌激素的抗炎和免疫抑制作用[5,6]。腹泻与肠道黏膜的损伤和各种炎性介质的释放有关，因而药物的抗炎效果也是其发挥止泻作用的重要机制之一。双葛止泻口服液由金银花、葛根、黄芩、黄连、白芍和炙甘草提取液组成，金银花对发热模型大白鼠及炎性模型小鼠均有防止体温升高和消除炎症的作用，表明金银花具有明显的清热解毒抗炎功效[7]。文献报道黄连中的小檗碱类和白芍中的主要成分白芍总苷（TGP）均能抑制二甲苯引起的小鼠耳肿胀，抑制率达73.9%和84.1%[8]，表明对炎症均有抑制作用。为了考察双葛止泻口服液在治疗疾病时对机体的抗炎作用，本试验采用二甲苯致小鼠耳肿胀模型来评价抗炎作用。由本试验结果可知，小鼠在给予一定量的双葛止泻口服液后可明显减轻二甲苯所致的耳肿胀，说明双葛止泻口服液能阻止炎性渗出并减少红肿，具有一定的清热抗炎作用。

4.2 番泻叶所致腹泻小鼠止泻作用研究

番泻叶主要成分为蒽醌类衍生物，番泻叶苷A、B、C、D，大黄酸、大黄素、芦荟大黄素和葡萄糖甙，是临床常用的泻下药。王胜义[9]等报道黄白口液能明显减少番泻叶引起的小鼠腹泻次数。毛莹[10]等报道的在以番泻叶致泻为模型，以腹泻指数为测定指标的试验中，葛根芩连汤能明显的减少番泻叶引起的小鼠腹泻次数，具有良好的止泻作用（P<0.01）。番泻叶腹泻模型使用较普遍；且使用番泻叶模型具有操作简单，周期短，模型稳定，重复性好，发病率高等特点，常作为筛选抗腹泻药物的模型。

本研究采用腹泻指数作为指标来评价双葛止泻口服液的止泻作用，在番泻叶腹泻模型中应用腹泻指数这一指标来反映稀便的程度，既可考虑到稀便量的变化，又能考虑到质的因素，比单用稀便率与稀便级这两个指标更全面更客观，并使之具有可比性[11]，故本试验采用的评价指标为腹泻指数。

采用番泻叶造模后，各组小鼠均出现腹泻症状，灌服番泻叶后0～6h 观察结果可知，各给药组与模型对照组相比腹泻指数均极显著降低（P<0.01），本试验结果与文献报道基本一致，表明双葛止泻口服液对番泻叶所致小鼠腹泻有一定的止泻作用，能减轻小鼠的腹泻程度。

4.3 小鼠肠运动影响试验

双葛止泻口服液中的君药葛根具有解肌退热、止泻等功效[12]，其主要成分为葛根素、大豆苷等异黄酮类化合物。钟凌云等[13]进行了葛根主要药效成分止泻作用研究，结果表明葛根中的葛根素、大豆苷能极显著降低小肠推进率（P<0.01），随给药剂量的增加，小肠推进率呈减弱趋势，在一定剂量范围内存在良好量效关系。文献报道表明，葛根素与大豆苷元具有明显抑制胃排空和小肠推进率作用，临床上可用于治疗泄泻[14-16]。

本研究通过小肠推进性运动试验，计算墨汁推进率，观察不同剂量的双葛止泻口服液对胃肠蠕动的作用影响。结果显示，与空白对照相比，双葛止泻口服液中（5.56mL/kg·d-1）、高（11.12mL/kg·d-1）剂量均能显著抑制胃肠蠕动，抑制小肠推进（P<0.05），高剂量组肠推进百分率低于中剂量组。表明双葛止泻口服液具有明显抑制小鼠小肠推进作用，该作用是抑制腹泻的重要机制之一，且该作用具有一定的剂量相关性。