NexGard 中阿福拉纳提取与纯化工艺研究
2021-01-09赵晶晶
赵晶晶
(山西省畜牧产品质量安全检验监测中心太原 030027)
随着我国社会经济的快速发展,人们对生活品质的要求日益提高,越来越多家庭加入科学养宠队伍,据粗略统计目前中国在册的宠物犬数量已超7,500 万,其中,城镇地区养犬量超5,500 万只[1,2]。然而,宠物犬好动,喜欢到处玩耍、闻舔,极易感染寄生虫病、皮肤病、传染性疾病等,其中以寄生虫病最为多发。常见的体外寄生虫有蜱虫、跳蚤等,体内寄生虫有心丝虫、蛔虫、钩虫、鞭虫等,不仅影响宠物的身心健康,还因繁殖力强而污染环境,进而给人的健康带来隐患;此外,也极大地减弱宠物主与宠物的亲密接触意愿,因此,防治宠物犬寄生虫病尤为重要[3,4]。
临床上,宠物犬体内寄生虫病的防治主要依赖大环内酯类抗寄生虫药物,应用最为广泛的有伊维菌素、塞拉菌素、莫昔克丁、米尔贝肟等。近年来,药物化学家们依次发现几种新型异噁唑啉类小分子化合物对犬跳蚤和蜱虫等体外寄生虫有突出的药理活性,如阿福拉纳(a foxolaner)[5]、氟雷拉纳(fluralaner)[6]、沙罗拉纳(sarolaner)[7]和洛替拉纳(lotilaner)[8](结构如图1所示),该类药物拟通过抑制GABA氯离子通道,使节肢动物神经高度兴奋导致死亡,是强效杀虫剂。2017年8月,勃林格殷格翰宣布其针对跳蚤和蜱虫两类寄生虫的犬用口服驱虫药“尼可信”(NexGard,商品名为阿福拉纳咀嚼片[9])在中国上市,次年8月又宣布首个犬用口服体内外寄生虫同驱产品“超可信”(NexGardSpectra,商品名为阿福拉纳米尔贝肟咀嚼片)在中国上市。这两款宠物药很快在中国宠物市场占领了一席之地,消费者反馈良好。我国很多新药研发机构也纷纷加入这两款药物的自主研发,期望以“阿福拉纳”为敲门砖,启发开拓异噁唑啉类活性物质研发思路。
我国关于阿福拉纳的各项研究均处于萌芽阶段,化合物的合成及纯化、成品的质量研究及药理毒理研究均未取得较理想的成果。造成这一难题无法向前推进的一个基本原因,就是无法取得对照品或高纯度样品,使得现有研究成果可靠性、科学性和严谨性都十分不足,包括结构确证、分析方法等研究方面均无法准确定位。陈春青等人[10]早前发明了同类产品“氟雷拉纳(fluralaner)咀嚼片”中提取并纯化主成分的方法,满足了前期对较纯化合物的量的需求,并为后期检验工作提供了参考。目前,阿福拉纳对照品暂无销售渠道,本试验或能参考此专利方法,试从上市制剂“尼可信”中提取出阿福拉纳化合物,经过进一步的分离纯化从而得到高纯度产品,纯度检测采用薄层色谱和高效液相色谱法相结合,该研究内容国内外均未见报道。Zhuang 等人[11]运用手性HPLC 法对阿福拉纳作了大量分析,这为本方法中HPLC 法的建立提供了基础依据。本方法能够快速解决短期内因合成工艺复杂而无法取得一定需求量的化合物(纯度符合要求,不低于99%),也能为后期关于该药物药动、药代学研究样品前处理方法中的几项参数确定提供研究思路,如组织中药物提取溶剂、方法、萃取溶剂等。
图1 四种兽医临床常用的异噁唑啉类驱虫药
1 材料与方法
1.1 主要材料与仪器
1.1.1 材料与试剂阿福拉纳咀嚼片(梅里亚有限公司法国吐鲁兹生产厂,规格:136mg);100~200 目层析硅胶、磷酸、二氯甲烷、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、石油醚(国药试剂,AR);乙腈(HPLC)。
1.1.2 主要仪器万能粉碎机、磁力搅拌器、反应瓶、油浴锅、冷凝管、水泵、布氏漏斗、旋转蒸发仪、层析柱、微量进样器、硅胶板G254、紫外分析仪、紫外-可见分光光度计、超纯水仪、高效液相色谱-串联质谱仪、红外光谱仪、核磁共振波谱仪。
1.2 试验方法
1.2.1 粉碎取60 粒阿福拉纳咀嚼片,约300g,置于万能粉碎机中,粉碎成小颗粒状,备用。
1.2.2 提取取粉碎后样品约10g (相当于2 粒阿福拉纳咀嚼片,含C26H17ClF9N3O3约272mg),加入提取溶剂(从4 种常用溶剂中筛选),开启搅拌,加热至回流,抽滤。滤渣同法进行二次提取,合并滤液,照薄层色谱法进行TLC 点板,在紫外分析仪254nm 处检测,判定主斑点深浅及杂质斑点个数及深浅,粗略判定纯度;然后置于旋转蒸发仪进行减压浓缩至干,得粗品(TLC 纯度不低于85%)。
1.2.2.1 溶剂的选择分别选择4 种常用溶剂(包括二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯、石油醚)按1.2.2 项下提取方法进行提取试验,筛选出最优提取溶剂。
1.2.2.2 溶剂量的确定分别加入样品的10 倍、20 倍、30 倍体积质量比的1.2.2.1 项筛选出的最优提取溶剂,照1.2.2 项下提取方法进行提取试验,确定最优提取溶剂量。
1.2.2.3 回流时间的确定在样品中加入1.2.2.1 项和1.2.2.2项择出的最优溶剂种类及溶剂量,照1.2.2 项提取方法进行试验,分别回流1h、2h、3h,筛选出最合适的回流时间。
1.2.3 分离纯化取定量粗品进行柱层析分离,湿法上样,以二氯甲烷/ 甲醇(40:1,v/v)为洗脱液进行洗脱,收集洗脱液并即时进行紫外分析,待分析结果显示有目标单体时(粗品点板主斑点Rf值作为参考对照),开始收集洗脱液并做标记,至分析结果无目标物时,结束收集,合并所有标记的洗脱液,浓缩至干,得产品(TLC纯度不低于95%)。
1.2.4 最大吸收波长测定取样品适量,加流动相溶解并稀释制成5μg/mL 的溶液,在200~600nm 测定吸光度,供试品在312nm 附近有最大吸收。
1.2.5 纯度测定建立HPLC 检测方法并进行方法学验证,按面积归一化法计算纯度。
1)色谱条件:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,推荐AgilentZorbaxSB-C18(150mm×4.6mm,5 μm);以0.05%磷酸溶液(pH 2.4)为流动相A,乙腈为流动相B,按下表进行线性梯度洗脱;检测波长为312nm;流速为1.0mL/min;柱温为35℃;进样体积为20μL。
表1 流动相梯度
2)分析方法:取纯化后样品适量,精密称定,加流动相超声溶解并定容制成5μg/mL的溶液,摇匀。精密量取20μL注入液相色谱仪,按面积归一化法以峰面积计算。
3)标准曲线绘制:分别配制2、4、5、10 和20μg/mL的对照样品供试液,依次进样,得到色谱图,按面积归一化法,用峰面积对进样浓度进行线性回归分析。
4)精密度:取对照样品溶液(5μg/mL)连续进样5 次,记录色谱图,计算RSD。
5)溶液稳定性:将对照样品溶液(5μg/mL)分别于0、2、4、6、8、12 和24h 取样分析,记录色谱图,计算RSD。
6)重现性:称取对照样品6 等份,配制为5μg/mL,进样,记录色谱图,计算RSD。
7)准确度:称取3 份对照样品,分别配制为4、5 和6μg/mL,进样分析,记录色谱图,计算回收率及RSD。
1.2.6 结构确证依次通过红外光谱(IR)、质谱(MS)、核磁共振氢谱(1HNMR)进行结构确证。
2 结果与分析
2.1 提取方法的确定
2.1.1 不同提取溶剂对提取效率的影响由表2 可知,二氯甲烷的提取效率最好,因此二氯甲烷为本试验最优提取溶剂。
表2 不同溶剂对提取结果的影响
2.1.2 不同溶剂量对提取效率的影响采用二氯甲烷按1.2.2 项提取方法进行试验,分别吸取部分提取液稀释至同一比例后再进行TLC 点板,结果显示20 倍、30 倍体积比的二氯甲烷提取效率较好(表3),考虑到经济环保,最终选择20 倍体积比二氯甲烷为最优提取溶剂量。
表3 不同溶剂量对提取结果的影响
2.1.3 不同回流时间对提取效率的影响采用20 倍体积比的二氯甲烷按1.2.2 项提取方法进行试验,结果显示回流2h、3h 后的提取效率较好(表4),考虑到操作效率,最终选择回流2h 为最优回流时间。
表4 不同回流时间对提取结果的影响
2.2 分离纯化结果
由表5 可知,采用20 倍体积比的二氯甲烷提取,回流2h 后进行柱层析分离纯化的效率可观,3 批次提取纯化的阿福拉纳提取率均达到80%,TLC 点板显示无杂质斑点,主斑点深,说明提取物纯度极高。
表5 提取纯化结果
2.3 样品中阿福拉纳纯度测定
本试验经多次条件摸索,最终建立了高效液相色谱法测定阿福拉纳纯度,该方法经系统方法学验证,准确度良好,4、5 和6μg/mL浓度的回收率分别为99.55%、99.34%和99.86%;精密度高,连续进样,主峰峰面积RSD 低于2.0%,重现性好;在2~20μg/mL呈现良好的线性相关(r>0.999)。
3 批次提取纯化样品的纯度测定结果分别为99.52%、99.26%和99.31%(图2),达到药物研发工作对标准物质的纯度需求。
图2 阿福拉纳(3 批次)液相图谱
2.4 样品中阿福拉纳的结构确证
本试验提取纯化的阿福拉纳经红外光谱、质谱及核磁共振光谱法分别分析鉴定,图谱见图4~6,其特征结构由以下特征数据确证:
1)红外光谱[IR(KBr),ν(c m-1)]:3305,1694,1653,1529,1331,1306,1277,1240,1169,1137c m-1。
图3 阿福拉纳结构
2)质谱[ESI-MS(m/z)]:648.2[M+Na]+。
3)核磁共振氢谱[1HNMR(300MHz,DCl3),δ(p p m)]:1H NMR(300MHz,DMSO-D6),δ(p p m):8.95 (t,1H),8.84(d,1H),8.74 (t,1H),8.40 (d,1H),8.10 (d,2H),7.93(d,2H),7.75-7.04(m,3H),4.64(s,2H),4.08-4.00(m,4H)。
3 讨论
本试验确定的提取方法操作简便,所用试剂易得且可回收,提取率达到80%;提取产物经纯化后,产品纯度达到99%,显示提取与纯化方法符合高效便捷的实际应用要求。本试验中建立的纯度检测方法可靠,准确度和精密度均符合兽药检测标准。此外,本试验还对国内不同厂家提供的阿福拉纳原料进行了较系统全面的质量研究,各家产品仅在纯度控制上有差异,这与合成工艺的不同息息相关,后期对杂质的控制与研究应进一步加深。
阿福拉纳目前在国外已被广泛应用,我国引入后应用反馈也十分满意,但国内关于阿福拉纳的各项研究均处于起步阶段,相关报道也甚少。根本原因为阿福拉纳进口对照品价格昂贵,难于获得且合成难度大,因此,本试验提供的快速获得高纯度的原料方法将为我国自主研发阿福拉纳及其相关类型的新药提供新思路与动力。本试验建立的提取方法也可为阿福拉纳制剂研究及药代动力学研究过程中样品前处理方法的建立打下基础,建立的高效液相色谱法为之后该药物系统的质量研究工作具有重要指导意义。
图4 阿福拉纳红外光谱图
图5 阿福拉纳质谱图
图6 阿福拉纳核磁氢谱图