新型小动物口鼻暴露系统对叶菌唑原药急性吸入毒性试验

吴宗澄，张述阳，张智博，张晓军，金 迪，王华琳

(沈阳沈化院测试技术有限公司安全评价中心/国家沈阳新药安全评价研究中心，沈阳 110141)

1 引言

叶菌唑原药是一种新型三唑类广谱内吸性杀菌剂，主要用于防治小麦赤霉病、小麦白粉病以及小麦锈病等禾谷类作物病害[1]。对壳针孢属和锈病活性优异，兼具优良的保护及治疗作用，既可茎叶处理又可作种子处理[1, 2]。叶菌唑是生产上控制小麦病害的重要杀菌剂品种[1, 3]。该杀菌剂杀菌活性高、抗菌谱广、内吸性强, 在农药领域中举足轻重[1, 4]。目前，国内外有关于叶菌唑毒性测定LD50值(mg/kg)的报道，其中雄性大鼠急性经口剂量为2000 mg/kg、雌性大鼠>2000 mg/kg，雄性大鼠的急性经皮试验浓度>2000 mg/kg、雌性>2000 mg/kg，叶菌唑对家兔皮肤无刺激性，对家兔眼睛为轻度刺激性[1, 5, 6]。关于叶菌唑气相色谱-质谱法( GC-MS)、气相色谱-串联质谱法( GC-MS /MS) 以及高效液相色谱-串联质谱法( HPLC-MS /MS) 检测方法均有报道等[6, 7]。但有关叶菌唑原药大鼠吸入毒性的报道很少，既原有的试验数据是使用旧型暴露系统测试得到的吸入毒性试验数据，但旧型暴露设备及吸入毒性试验方法陈旧，科学性误差较大，暴露效果缺乏，数据可靠性低。本实验参照OECD化学品测试为准则[8]，利用新型口鼻暴露系统对SD大鼠的急性吸入毒性试验来测定叶菌唑原药的急性吸入毒性，了解其经呼吸道进入动物机体后对呼吸道以及全身的损伤和危害程度，为该农药的毒理学安全评价提供较为可靠性的科学资料，为其亚急性吸入毒性试验及亚慢性吸入毒性试验奠定了基础。

2 材料与方法

2.1 受试物与仪器

叶菌唑原药为白色固体粉末，纯度为95%，由某农药公司提供。称取60.0 g受试样品，先用研砵进行研磨，把样品中的颗粒物研碎，再用九阳磨粉机进行粉碎，最后用行星式球磨仪研磨，处理完毕之后在用铜网进行筛选，筛选完毕的样品存于样品室待用。所用主要仪器为：新型小动物口鼻单浓度动态暴露系统选购于北京慧荣和科技有限公司，304不锈钢300目筛网购自安徽亿汇筛网有限公司，行星式高能球磨仪选购于德国莱驰公司，安德森串级撞击器粒径分析系统购于北京赛克玛环保仪器有限公司。

2.2 动物来源与饲养环境

SPF级SD大鼠60只，雌雄各半，由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供(许可证号：SCXK(京)2016-0002)。引入动物后适应时间为5d，每笼2只动物，并在引入当天进行适应期观察，健康检查与体重称量。实验动物所食饲料为灭菌全价型营养粉料，可自由饮水，动物房温度为20～25 ℃，湿度为40%～70%，光周期自动控制，每天明暗各12 h。同时进行适应性保护和固定，以确保在正式试验时实验动物能够适应固定器所带来的物理压力，温度压力及行动障碍。

2.3 试验方法

2.3.1 剂量设计

参照OECD化学品测试导则，设计5000 mg/m3、2000 mg/m、31000 mg/m3、0 mg/m3，根据体重采用随机分组法分为4组，对照组和高剂量组每组20只，雌雄各半，低剂量和中剂量组每组10只，雌雄各半。分组时组内动物体重不能超过平均动物体重的±20%，若5000 mg/m3剂量的实验动物组均未出现死亡，则急性吸入毒性试验LC50的判定结果大于5000 mg/m3。

2.3.2 暴露途径及方法

采用动式吸入暴露方法，使用新型小动物口鼻单浓度动态暴露系统对动物进行吸入暴露。多节口鼻暴露单元沿着内筒的轴线顺次连接组成口鼻暴露组，在口鼻暴露塔的顶端连接粉末气溶胶发生器，底端连接废气回收处理装置。试验设计的4个剂量同时运行4台小动物单浓度口鼻暴露系统进行测试试验，空白组试验参数方案与高剂量组一致。试验开始前，将动物分别放入固定器中，动物给药前先对口鼻暴露组内浓度进行调试，通过调整发生器进给速度，进气流量及稀释流量来调试暴露腔内气溶胶浓度，如果连续2次检测浓度波动范围小于±20%，则可以进行正式试验，将装有实验动物的固定器安装在口鼻暴露塔上，暴露时间为4h，暴露期间实验动物禁食禁水。染毒结束动物放回笼内并观察，自由饮水和摄食。

2.3.3 供试品暴露参数检测

染毒过程中对样品实际浓度和粒径分布进行测定、监测及统计分析，并对气溶胶流量、进样速度、稀释流量，抽气流量，暴露腔内温度、压力、相对湿度、氧气浓度和二氧化碳浓度进行实时监测。暴露系统对环境参数采用每秒自动监测，监测数据自动记录于设备中，试验结束自动生成试验报表，数据显示整个暴露期间参数均值。

浓度测量：采样前称量滤膜重量为M1，采样结束后称量滤膜和样品重量为M2，计算采样重量(M)，M=M2-M1，暴露腔内气溶胶浓度为C(mg/m3)=采样质量(M)/采样体积(V)×1000(L/m3)。

粒径测定：使用安德森串级撞击器粒径分析系统对暴露腔内粒子空气动力学直径进行测定。主要测定2个指标： ①粒子空气动力学直径质量中值(MMAD)，②粒子空气动力学几何标准差(GSD)。

2.3.4 实验动物观察与体重称量

暴露结束时应对所有实验动物进行观察，在试验结束约1 h后对所有实验动物再进行一次症状观察，从试验开始到结束，应每天进行症状观察并记录各实验动物中毒症状及其发生和缓解、消失的时间。应详细记录被毛、呼吸系统、生殖系统、泌尿系统、神经消化系统，眼睛和粘膜所产生的症状变化，特别注意观察供试品对呼吸系统的影响，如供试品对实验动物的呼吸道产生刺激反应，呼吸频率的变化以及呼吸和呼吸模式的改变。

体重称量：实验动物引入24 h之内，暴露前1 d，暴露日暴露前(第0)，暴露后第1 d、第3 d、第7 d和第14 d进行体重测定。

2.3.5 大体解剖检查

试验结束后对全部存活动物 CO2麻醉，并对实验动物进行放血与解剖检查。动物进行大体解剖时应全面仔细观察肺部及上呼吸道的刺激以及局部毒性刺激产生的症状，同时检查胸腔、腹腔、颅腔、各个天然孔道及其内容物，并详细记录每只动物的解剖后的症状变化。

2.3.6 组织病理学检查

试验期间死亡的动物以及试验结束后的剩余动物都应进行解剖和组织病理学检查。

2.3.7 数据处理和结果评价

分别统计不同剂量组的动物数目、出现的症状、存活数与死亡数，及时观察大体解剖与病理学组织学检查时各个器官所发生病变的频率并计算各剂量组中雌雄动物产生该上述项目的发生频率，统计不同时间内实验动物的体重均值与标准差。

根据供试品浓度和动物死亡率，使用SPSS19.0软件计算急性吸入的LC50的值。根据LC50的结果与表1和表2进行毒性分级。

表1 GHS急性吸入毒性分类标准

表2 毒性分级

3 结果分析

3.1 暴露期间环境参数均值

在暴露过程中对暴露腔内气溶胶流量、稀释流量，暴露腔内温度、相对湿度、氧气浓度和二氧化碳浓度等导则要求的环境参数进行实时监测，暴露系统对环境参数采用每秒自动监测，监测数据自动记录于设备中，试验结束自动生成试验报表，数据显示整个暴露期间参数均值，结果见表3.

3.2 实际浓度和粒径分布

暴露期间暴露腔内的气溶胶实际浓度被测量，从高到低实际浓度分别为5038±33、2065±50、1005±25 mg/m3。实测浓度结果见表4。

使用粒子空气动力学粒径谱分布仪管理软件进行采集和测定，主要测定两个指标:①粒子空气动力学直径质量中值(MMAD)，②粒子空气动力学几何标准(GSD)，结果见表5。

表3 环境参数结果

表4 实际浓度结果

表5 粒径分布

3.3 死亡结果及观察

5000 mg/m3剂量组雌雄动物吸入暴露结束后第1 d，雌雄各2只动物出现自发运动低下症状，暴露第2 d，雌性2只动物死亡，3只穿自发运用低下，呼吸声音异常，步行困难等症状，雄性3只死亡，2只出现自发运动低下，口鼻周有分泌物症状；第3 d雌雄动物全部死亡。

2000 mg/m3剂量组吸入暴露第1 d后，雌性1只动物出现自发运动低下，雄性1只动物死亡；吸入暴露2 d后，3只出现被毛蓬松，会阴污秽，1只出现被毛蓬松，口鼻周有分泌物；2只自发运动低下；吸入暴露第3 d后，雌性2只死亡，雄性症状逐渐恢复；吸入暴露第4 d后，所有动物症状减轻；吸入暴露第5 d后，所有实验动物均正常。

1000 mg/m3剂量组和空白对照组给药后没有死亡，连续观察14 d至试验结束没有异常改变。

3.4 体重称量结果

高、中和低浓度组动物体重在暴露后第1 d雌雄都呈现体重降低趋势，在第3 d都基本恢复正常，一直到试验结束都呈现增长趋势，结果见表6。

表6 体重称量结果

3.5 解剖与组织学观察结果

高和中剂量组动物的死亡解剖均发现肝脏暗红色症状，有肺部红斑症状；其他计划解剖未见异常；组织学所见：叶菌唑原药对高剂量组和中剂量组死亡动物的肝脏有轻度的致肝细胞肥大的作用和对肺脏有致泡沫细胞团的作用。

4 结论与讨论

根据叶菌唑暴露浓度和动物死亡率，使用SPSS19.0软件用概率单位法方法计算急性吸入的LC50的值，雄鼠为2221 mg/m3，雌鼠为2064 mg/m3。根据之前报道过的叶菌唑大鼠急性经口毒性LD50为雄性1470 mg/kg，雌性1080 mg/kg ，大鼠急性经皮毒性LD50为>2000 mg/kg，同时根据GHS标准(表1)对烯肟菌酯进行急性毒性分级，烯肟菌酯原药急性吸入毒性为4级，属于低毒。同时结果表明：叶菌唑对靶器官为肝脏和肺脏。

小麦作为重要的粮食作物，在中国人餐桌上的呈现形式多种多样。因此，优质小麦种植的意义深远，小麦的安全生产备受关注。实现优质小麦的无公害生产，提高国际市场的竞争力，增加农民收入，是我国现代农业发展的必然趋势。叶菌唑原药是一种活性高、抗菌谱广、内吸性强的杀菌剂，主要用于防治小麦赤霉病、小麦白粉病以及小麦锈病等禾谷类作物病害[1]。对壳针孢属和锈病活性优异，兼具优良的保护及治疗作用，既可茎叶处理又可作种子处理。叶菌唑是生产上控制小麦病害的重要杀菌剂品种。但有关叶菌唑原药吸入毒性的报道尚未见到。本试验使用新型小动物口鼻暴露系统来检测叶菌唑原药对SD大鼠的急性吸入性，了解了其吸入动物呼吸道后对呼吸道与全身的损伤以及危害。对未来叶菌唑的安全使用可提供有效的试验依据。