微小核糖核酸在乳腺癌中的研究进展

张娜娜,沈 滨,陈 晰,梁文龙,张建国

(哈尔滨医科大学附属第二医院 乳腺外科,黑龙江 哈尔滨,150086)

全球超过226万女性患乳腺癌，约占所有新确诊癌症人数的11.7%,占女性新确诊癌症人数的24.5%,发病率居女性癌症首位。目前已有肿瘤相关蛋白如CEA、CA153等用于肿瘤辅助诊断，但敏感性和特异性较低。早期诊断乳腺癌并及时治疗是提高患者生存率的关键所在，因此需要找到敏感性和特异性较高的检测方法。微小核糖核酸(miRNAs) 是一类高度保守、长18～25个核苷酸的内源性单链非编码小分子RNA[1-2]。miRNAs由DNA转录产生，但不翻译成蛋白质，而是调节其他基因的蛋白质合成，因此miRNAs 可调控其他蛋白质编码基因。其参与生物体细胞分化、增殖、衰老、代谢、病毒防御、器官形成、胚胎发育以及免疫应答等生命活动[3-7],与肿瘤、心脑血管疾病、代谢性疾病及免疫性疾病等疾病的发生发展密切相关[8]。在肿瘤中,miRNAs通常以癌基因或抑癌基因的角色参与肿瘤的发生发展。抑癌性 miRNAs(suppressor-miRNAs)与肿瘤发生呈负相关，其表达下调或失活将直接导致肿瘤的发生发展;致癌性miRNAs(onco-miRNAs)与肿瘤发生呈正相关，其过表达或持续活化将直接导致肿瘤的发生发展[9]。miRNAs通过其靶基因、上游转录因子及各种反馈调控回路相互交织组成了复杂的生物调控网络，并参与肿瘤的发生发展机制。存在于外周血和体液中的游离miRNAs (循环miRNAs),具有出现早、稳定性高、组织和肿瘤特异性等优点，是最具潜力的肿瘤分子标志之一，有望应用于乳腺癌的早期诊断、分子分型、疗效监测与预后预测等各个阶段。

1 miRNAs的形成

核基因组中的miRNA首先在RNA聚合酶Ⅱ的作用下转录为具有茎-环结构(stem-loop struc-ture)的初级miRNA(pri-miRNA),后者被RNA聚合酶Ⅲ-Drosha-DGCR8 复合体切割，形成仍保留茎-环结构的前体miRNA(pre-miRNA)。转运蛋白输出蛋白5 (Exportin-5)将识别其突出于3′端的标志并与之结合，借助G蛋白(Ran-GTP)转运至细胞质。在胞质中，一种叫Dicer的核酶将在双链RNA结合蛋白(TRBP)和AGO蛋白质2(AGO2) 的协助下识别前体miRNA双链的5′末端磷酸及3′末端突出，在RNA聚合酶III的参与下，于茎干的两个螺旋转弯处切割复式结构的两条链，形成miRNA:miRNA*复式结构。后者在解旋酶(helicase)的作用下，最终形成成熟的单链miRNA(多数为miRNA,miRNA*通常被降解)，进入核蛋白复合体参与形成RNA诱导的沉默复合体(miRISC),进而发挥生物学作用[10-12]。

2 miRNAs在乳腺癌中的功能

miRNAs不仅可调控乳腺相关癌基因、抑癌基因编码蛋白的表达，也可调控乳腺癌发生发展相关信号途径中蛋白、微环境中血管上皮细胞、免疫细胞的重要蛋白，并可通过调控药物靶分子、药物转运蛋白、甲基化或组蛋白修饰酶、细胞周期调控蛋白，影响药物敏感性和继发耐药等。miRNAs调控细胞内的转录和翻译，还以微囊或外泌体为载体，通过“细胞间信息传递”调控其他细胞。研究[13]发现高转移性乳腺癌细胞分泌含有miR-200的外泌体，被低转移性乳腺癌细胞内吞后，转化为高转移性乳腺癌细胞。血清外泌体mir-373可作为侵袭性、三阴性和激素受体阴性乳腺癌的生物标志物。血清外泌体miR-105可能具有预测或早期诊断发展或已经发展为乳腺癌转移的潜力[14]。

2.1 miRNAs与乳腺癌的发生发展以及侵袭转移

miRNAs 在正常组织及肿瘤中表达存在着显著差异，这种miRNAs表达的多态现象与肿瘤发生转移的风险存在正相关或负相关。研究[15]发现在原发性乳腺癌血清中miRNA-21、miRNA-29b、miRNA-29c、miRNA-98、miRNA-181b、miRNA-181d、miRNA-155、miRNA-365表达上调，miRNA-30a-3p、miRNA-31、miRNA-127、miRNA-140、miRNA-320、miRNA-355和miRNA-497表达下调，其中miRNA-21上调最为显著，与肿瘤进展、淋巴结转移、生存时间有关。数据表明,miR-182-5p和miR-409-3p降低了Ras抑制蛋白1(RSU1)、PINCH蛋白1(PINCH1),抑制了PTEN(一新发现的抑癌基因)表达的ATF2激活[16]。TINCR(长非编码lncRNA命名的组织分化诱导非蛋白编码RNA)在乳腺癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织(P<0.001),在癌组织中miR-589-3P表达水平显著低于正常组织(P<0.001)。TINCR和miR-589-3p表达水平呈负相关(r=-0.331;P=0.006)。Kaplan-Meier总体生存曲线结果表明,TINCR表达高水平的患者在5年内生存率较低(P<0.05)。miR-589-3p可能靶向下调乳腺癌细胞TINCR的表达，抑制乳腺癌细胞增殖，促进其凋亡[17]。miRNA-205在三阴性乳腺癌中表达下调，通过靶向控制ZEB1、ZEB2来减少MET(上皮细胞-间充质转化)的过程[18]。miR-183/-96/182簇在乳腺癌中表达也上调[19]，其异位表达促使乳腺癌和其他癌细胞[20-21]的细胞增殖、迁移和上皮间充质转换(EMT)。在乳腺癌中，大约75%的晚期乳腺癌患者检测到骨骼转移[22],尽管乳腺癌的治疗有所改善，但在骨转移的发展阶段，乳腺癌目前是无法治愈的，因此骨转移诊断后的中位生存时间在12～53个月[22]。骨转移降低了患者的生活质量，缩短了患者的预期寿命。在一项关于乳腺癌分子亚型的研究[23]中,Ki67的免疫组织化学染色与人表皮生长因子2(HER2)和雌激素受体(ER)的分析相结合，结果显示ER阳性HER2阴性肿瘤的骨转移率较其他亚型高，Ki67评分大于13。研究[24]表明,miR-30家族成员在骨转移中的作用是通过调控miR-30的过度表达来抑制骨中肿瘤的生长，减少骨破坏，抑制癌细胞侵袭。miR-30水平与ER/PR状态相关,ER/PR阴性细胞表达的miR-30家族成员水平低于ER/PR阳性细胞[24]。乳腺癌脑转移同样是治疗的一大难点，血脑屏障限制药物进入和引起肿瘤细胞死亡，使大脑成为“避难所”。miR-101-3p的表达在脑转移性乳腺癌细胞中丢失，而miR-101-3p的异位表达通过减少环氧化酶(COX-2)/基质金属蛋白酶-1(MMP1)表达来减少癌细胞通过脑内皮细胞的迁移，从而干扰内皮间连接，即BCBM(乳腺癌脑转移)级联由miRNAs调控[25]。miRNAs通过各种调节通路控制着乳腺癌的发生发展以及侵袭转移。

2.2 miRNAs与乳腺癌的诊断

一些miRNAs在乳腺癌早期表达异常，循环miRNAs由坏死肿瘤细胞释放或活肿瘤细胞主动分泌，直接来源于肿瘤细胞[26],可能与肿瘤细胞存在一致性。相关研究[27]选择5种分子亚型中显著差异表达的miRNAs和mRNAs,选择有效的miRNAs和mRNAs子集，用于乳腺癌亚型的分层。6个miRNAs (miR-190b、miR-18a、miR-301a、miR-34c-5p、miR-18b和miR-129-5p),6个mRNAs (HAUS6、LAMA2、TSPAN33、PLEKHM3、GFRA3和DCBLD2),结果表明，所选择的miRNAs和mRNAs对乳腺癌亚型分层具有重要意义，这12个miRNAs和mRNAs可作为乳腺癌亚型分层的诊断生物标志物。ROTH C等[28]对59例原发乳腺癌患者、30例转移性乳腺癌患者和29例健康对照者的血清miRNAs比较分析，发现miR-155、miR-10b和miR-34a水平不仅可区分乳腺癌与健康对照，而且可鉴别原发和转移性乳腺癌。SCHWARZENBACH H等[29]研究了102例术前和34例术后乳腺癌患者、32例良性肿瘤患者和53例健康人血浆miRNAs水平，发现miR-20a和miR-21在良、恶性肿瘤患者均高于健康对照，而乳腺癌患者血浆miR-214显著高于良性肿瘤患者。可见循环miRNAs具有组织和肿瘤特异性，其含量和组成变化直接反映肿瘤来源和发生，并且有些miRNAs在肿瘤发生的早期出现，具备肿瘤诊断生物标志的潜力。

循环miRNAs对早期乳腺癌检测敏感性和特异性优于目前临床常用的肿瘤标志物检测,LIU L等[30]研究分析表明miRNAs对乳腺癌诊断的总敏感性为77%,特异性为88%。GAO J等[31]对89例早期乳腺癌患者和55例健康对照者分别采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定循环miR-21,用化学荧光法检测CEA和CA-153,循环miR-21检测敏感性为87.6%,特异性为87.3%,CEA和CA-153的敏感性分别为22.4%和15.7%。新一代测序和PCR芯片等高通量技术分析循环miRNAs表达谱，可提高检测的灵敏度。CUK K等[32]筛选出1组miRNAs (miR-127-3p、miR-376a、miR-652、miR-148b、miR-409-3p、miR-801、miR-376c)可鉴别乳腺癌和良性肿瘤(AUC=0.81),且对年轻女性(<50岁)的准确性更高(AUC=0.86)。

血清miRNAs主要检测方法有克隆测序、RNA印迹杂交、基因芯片、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)等技术。血清miRNAs稳定，可以抵抗核糖核酸酶 (RNAse)、加热、pH值变化，并能长期保存和反复冻融，可以实现无创检测[33]。血清miRNAs能够作为肿瘤的生物标志物，并可提供一种非损伤性的肿瘤诊断手段。

2.3 miRNAs与乳腺癌的治疗

miRNAs的表达失调可以引起多种疾病，因此调控miRNAs的表达也可以作为一种疾病的治疗手段。目前应用miRNAs治疗肿瘤的策略主要有:① 基因治疗，针对在肿瘤组织中下调的miRNA,转染pre-miRNA纠正miRNAs的表达，抑制肿瘤细胞的增殖或诱导其凋亡;利用反义RNA或小干扰RNA技术，有效抑制某个原癌基因miRNAs的表达。② 药物治疗，利用药物调控相关miRNA的表达，进而达到治疗目的。

KIM S J等[34]发现，在乳腺癌细胞系及乳腺癌癌组织中,miR-145与其靶基因(fascin-1、c-myc,SMAD2/3、IGF-1R等)存在负相关关系，研究者将腺病毒构建的miR-145用于乳腺癌细胞系的体外试验以及乳腺癌小鼠的体内试验，发现在体内及体外试验中腺病毒构建的miR-145均能抑制肿瘤细胞的生长和活力，且miR-145与5-氟尿嘧啶联合应用抑癌作用更佳，因此miR-145对治疗乳腺癌具有价值。KRÜTZFELDT J等[35]将与胆固醇偶联的反义寡聚脱氧核苷酸 (AMO) 注射小鼠静脉后，体内多种器官的miRNAs表达水平降低，且注射后第3日小鼠体内检测不到靶向miRNAs，并在数周内都未检测到，证明修饰AMO能较长时间内有效降低靶miRNAs的水平，因此这种修饰的AMO有可能成为新型治疗药物。丹麦SantarisPharma公司研发的miravirsen (一种靶向抑制miR-122的RNA候选药物)于2008年进入Ⅰ期临床试验治疗丙型肝炎病毒感染患者，并于2010年9月进行Ⅱ期临床试验，展示了miRNAs药物用于临床的可能性。白藜芦醇上调miR-141和miR-200c在MDA-MB231乳腺癌中的表达。上调miR-141和miR-200c可降低侵袭性和EMT[36]。姜黄素诱导mir-181b,抑制细胞增殖和转移，促进癌细胞凋亡[37]。在绿茶中发现的表没食子儿茶素-3-没食子酸酯可通过上调mir-16和阻碍Bcl2和mir-21抗癌[38]。因此乳腺癌miRNAs药物有望在临床上使用。

2.4 miRNAs与乳腺癌的疗效监测及预后

miRNAs可调控激素受体、药物代谢、细胞周期、凋亡、组蛋白修饰和DNA损伤修复等相关蛋白的表达[39],影响肿瘤细胞生长繁殖、侵袭转移，与乳腺癌的疗效及预后密切相关。

HENEGHAN H M等[40]对乳腺癌组和对照组血液中7种候选miRNAs比较分析，确认miR-195和let-7a在乳腺癌中高表达，手术切除肿瘤后分别降低11倍和19倍，因此miR-195和let-7a不仅可诊断乳腺癌，还可作为治疗效果评价指标。研究报道miR-10b、miR-21、miR-155表达水平高的TNBC(三阴性乳腺癌)患者预后较差，总生存期和无复发生存期均较短。MADHAVAN D等[41]采用miRNA芯片筛选与循环肿瘤细胞(CTC)状态相关的miRNAs,在61例阳性(CTC+)、60例低水平和72例阴性(CTC-)转移性乳腺癌(MBC)患者中验证，发现血浆miRNAs (miR-141、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-203、miR-210、miR-375、miR-801)在CTC+的MBC患者血浆中水平高于CTC-的MBC患者，其中miR-200b表达差异最为显著。单独miR-200b和上述miRNAs表达谱均与总生存期(OS)和无进展生存期(PFS)相关。MADHAVAN D等[41]发现在CTC阳性乳腺癌患者中循环miR-141、miR-200a、miR-200b、miR-203和miR-210表达水平升高,miR-375和miR-768-3p表达水平降低，循环miRNAs表达谱与患者总生存期的相关性高于CTC状态。EICHELSER C等[42]研究显示血浆中外泌体miRNA-373表达水平在TNBC和激素受体阴性(ER-/PR-)乳腺癌患者中高于激素受体阳性(ER+/PR+)乳腺癌患者,miR-373水平与侵袭表型相关。其他研究也相继发现血浆/血清miR-210、miR-21、miR-155、miR-214、miR-19a等表达水平与淋巴结转移或远处转移相关[43-45]。

3 miRNAs在乳腺癌中的应用前景及存在问题

循环miRNAs具备作为肿瘤生物标志的特征和临床应用潜力，但在成功应用于临床之前尚有一些理论和技术问题有待解决:① 乳腺癌与其他肿瘤一样存在高度异质性，发生和发展过程涉及多个基因的改变，相关miRNAs数量和种类众多，循环miRNAs既可由坏死肿瘤细胞被动释放，又可由活细胞主动分泌，因而循环miRNAs的组成和含量可能呈现随机性和动态波动性;② 研究对象的特征(年龄、种族、病理分期、肿瘤组织学分型和分子亚型)不同，患者的miRNAs表达谱可存在差异;③ 循环miRNAs的研究采用了全血、血浆和血清样本，全血标本因受到淋巴细胞内miRNAs的干扰，对结果的影响较大;血清和血浆相对更为稳定，但也存在细微差别，因在凝血过程中少量淋巴细胞裂解释放miRNAs，通常血清中miRNAs浓度略高于血浆;④ qRT-PCR是最常用检测方法之一,PCR结果的校正方法和参照不同也会产生偏差。在miRNAs的基因治疗中也存在需要解决的诸多问题，例如miRNAs与靶mRNA之间的作用依靠序列间的碱基互补配对，且miRNAs可以调控与之不完全配对的靶基因的表达。因此，一个miRNA可以调控多个靶基因的表达，可能产生脱靶效应。如何开发高效的miRNAs传递系统是研究的另一个重点，针对不同类型的肿瘤应采用不同的传递系统，更合适的传递系统仍需进一步研究。

随着循环miRNAs临床研究和方法的成熟，可以预期将来miRNAs可应用于临床肿瘤的早期诊断、用药指导和预后预测等。