中药有效成分直接作用靶点的鉴定方法及应用＊

李瑞梅，程 瑶，朱 朱，陈飞燕，戴建国，陈 琳，赵玉男

（南京中医药大学医学院/整合医学学院 南京 210023）

在药物疗效的证实或证伪中，“药效-机制-靶点”可看做是一条“证据链”，其中靶点是重中之重[1]。目前，对中药药效和作用机制的研究相对比较成熟，但是对其靶点的探索尚处于起步阶段。医药界对于阐释药物的靶点有迫切需求，中药靶点的鉴定对其在临床的应用和现代中药的开发均具有重要的意义[2]。

目前，探索天然产物靶点的方法主要包括标记法和非标记法：标记法首先需标记待研究的天然产物，进而阐明它们在蛋白质组中的结合物，例如亲和垂钓技术和噬菌体展示技术；由于标记天然产物费时费力，而且小分子结构的改变也可能导致非特异性结合，产生假阳性结果[3]，因而非标记法应运而生，例如：Drug Affinity Responsive Target Stability（DARTS）、Cellular Thermal Shift Assay（CETSA）、Stability of Proteins from Rates of Oxidation（SPROX）等技术。此外，还有一些基于基因组学和生物信息学的方法，预测小分子体内的作用靶点。运用这些新方法鉴定天然产物靶蛋白的同时，还应进行靶蛋白的确定及随后的效应分析，从而构建“药效-机制-靶点”证据链。

1 基于标记法对分子靶点的探索

1.1 亲和垂钓技术

该方法利用生物分子之间的亲和力原理，将小分子制成固相吸附剂并放置在层析柱中，将蛋白混合液倒入层析柱时，与吸附剂具有亲和力的蛋白质被吸附在层析柱中，而其余没有亲和力的蛋白质不会停留，直接流出。随后选用合适的洗脱液，改变结合条件，将具有亲和力的蛋白质洗脱下来进行鉴定。

比如：刘传绪等[4]将腺花香茶菜中的活性成分腺花素作为分子探针，垂钓出其潜在的靶蛋白过氧化还原酶Ⅰ/Ⅱ，发现腺花素通过特异性靶向过氧化还原酶Ⅰ/Ⅱ，诱导急性髓细胞性白血病细胞分化，进而起到治疗作用；Dong 等[5]运用亲和垂钓技术发现天然产物Ainsliadimer A 可以选择性地与IKKα/β蛋白上保守的46 位半胱氨酸残基结合，进而通过变构效应抑制其活性以阻断NF-κB 信号通路，实现抗癌、抗炎作用；此外，亲和垂钓技术还运用于淫羊藿苷抗神经细胞凋亡的靶点研究、远志酯抗炎症作用的靶点探索等[6]。

本课题组以人参皂苷作为配体，与固相载体偶联制备亲和树脂，利用亲和垂钓技术鉴定出肌肉型肌酸激酶（CK-MM）可能是人参皂苷在骨骼肌中的潜在作用靶点之一。随后课题组以20(S)-原人参二醇（PPD）为代表通过生物膜层干涉技术、等温滴定量热法、分子对接等多种方法，验证了20(S)-PPD 与CK-MM 的特异性结合。体内外实验显示，20(S)-PPD 与CK-MM 的结合能提高CK-MM 的酶活，进而改善运动性能，从而发挥抗疲劳的药效[7]；此外，本课题组还通过亲和垂钓法结合SDS-PAGE 凝胶电泳、质谱法和生物膜层干涉技术等，探究人参总皂苷在脑内的潜在作用靶点，发现14-3-3蛋白是人参总皂苷脑内的作用靶点之一，人参皂苷体内代谢产物原人参二醇、原人参三醇可能是14-3-3蛋白的激活剂[8]。

亲和垂钓是最早提出、也是最经典的靶点发现方法，广泛应用于目标蛋白的鉴定，并取得了良好的效果。然而，这种方法也有局限性：固定化可能会导致天然产物活性的改变；相互结合处的空间结构容易受到阻碍，因此难以找出与该空间结构有亲和力的蛋白质。这些局限性导致利用此法鉴定小分子体内的作用靶点存在一些不确定性。

1.2 噬菌体展示技术

噬菌体展示技术最初由美国密苏里大学的Smith等人于1985年建立，它是将外源基因片段克隆至噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，以融合蛋白的形式呈现在噬菌体的表面，被展示的多肽或蛋白质可保持相对的空间结构和生物活性。该技术在抗原表位分析、分子间相互识别、新型疫苗及药物的开发研究方面有广泛的应用前景[9]。

近年来，噬菌体展示技术被运用于探索小分子药物体内的作用靶点[10,11]。该技术的筛选原理又称“生物淘洗”。与亲和垂钓原理相同，该法也是利用分子与配体之间的特异性亲和力进行的。首先，将待测的目标分子通过共价键固定化在载体上，加入噬菌体文库，令其进行充分的相互作用并结合选择，在此过程中，含有与目标分子特异性结合的噬菌体克隆将结合到载体上，未结合的噬菌体克隆直接被洗去。然后，使用缓冲液将已经结合的噬菌体克隆洗脱下来，用于感染宿主细胞进行扩增，获得的噬菌体重复上述的筛选。经过3-5 轮“吸附-洗脱-扩增”的循环式筛选，最终得到的噬菌体克隆经初步结合试验鉴定后，分别选取单个克隆进行基因序列分析，根据测序结果可得到其对应的氨基酸序列，即为与目标分子结合的靶蛋白序列。

噬菌体展示技术为小分子化合物靶蛋白的筛选与鉴定提供了有效的技术支持，许多研究者已将其运用于中药有效成分的研究中。Rodi等[12]运用该技术对抗癌药物紫杉醇进行随机筛选，结合ELISA 检测证实了Bcl-2 蛋白是紫杉醇在体内的作用靶点；Takakusagi等[13]利用该方法对噬菌体随机七肽库进行筛选，得到了抗肿瘤药物喜树碱的靶点蛋白；潘超等[14]利用全细胞差减筛选法对噬菌体十二肽库进行了3 轮淘选，随后进行DNA 序列分析，在随机挑选的32 个噬菌体克隆种，筛选到三水白虎汤作用于类风湿关节炎滑膜细胞的靶点；Wang等[15]通过噬菌体展示实验结合CETSA和Isothermal titration calorimetry（ITC）分析，发现人参皂苷Rh2 直接与重组或细胞内膜联蛋白A2结合，首次提出Rh2抑制癌细胞生长的细胞靶点和分子途径。

该技术的优点包括：基因型与表现型的直接联系，使得噬菌体文库可以经过简单易行的筛选后进行操作；噬菌体展示文库可提供大量的蛋白质或多肽的结构信息，实现了高通量和高效率筛选的可能性。不足之处在于小分子化合物的功能基团与固相载体偶联的同时，会使功能基团周边的空间结构受到阻碍，因此与该空间结构有亲和力的噬菌体克隆不会被“淘洗”出来；而且，通过噬菌体展示技术得到的只是“可能”的靶蛋白，还需要进一步的验证。

2 基于非标记法对分子靶点的探索

2.1 DARTS方案

DARTS 方案由加利福尼亚大学的Jing Huang 教授课题组于2009年在《美国科学院院报》（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，PNAS）上首次提出[16]，2011年和2015年，该课题组对此方案进行了更详细的阐述[17]。该技术巧妙地利用了蛋白酶保护现象，其原理为小分子配体与蛋白质结合后可增强该蛋白质的稳定性，避免其被蛋白酶降解，即靶蛋白的结构稳定性是通过其与相应配体的结合而改变的。通过联合使用液相色谱和质谱法，检测SDS-PAGE中的保护带，实现靶蛋白的鉴定。

近年来，基于该技术探索天然小分子产物体内作用靶点的报道不断涌现。比如，Derry 等[18]对葡萄籽提取 物（Grape seed extract，GSE）在 人 结 直 肠 癌（Carcinoma of colon and rectum，CRC）细胞中的潜在蛋白靶点进行了研究，结合液相色谱/质谱联用技术MASCOT 蛋白鉴定数据库，发现内质网应激反应蛋白可能是GSE 细胞内的作用靶点。进一步机制研究证实，GSE 确实能引起内质网应激反应，并强烈抑制PI3k-Akt-mTOR 通路对CRC 细胞的生物学效应。陈潇飞[19]探究四逆汤治疗心肌梗死的靶标蛋白，首先利用蛋白质组学技术在正常组织和心梗组织中鉴定出590 个相关蛋白，与模型组相比四逆汤给药组有81 个蛋白出现了显著变化；进而联用DARTS方案与双向荧光电泳技术筛选出11 个对四逆汤起作用的直接心肌靶标，分析结果显示，四逆汤治疗心肌梗死的作用主要是通过影响琥珀酸合成反应来实现。Dal Piza 等[20]人利用DARTS 技术发现，laurifolioside（大戟属植物Euphorbia laurifolia分离得到的天然产物之一）在PC-3和MCF-7 细胞中的直接作用靶点是内涵素重链1；进一步通过分子动力学模拟与分子对接等技术，推测了laurifolioside 与内涵素的结合构象、氢键疏水键作用位点及结合能量。Yang 等[21]人联合运用DARTS 技术和免疫沉淀液色谱/质谱分析，发现中药材骨碎补的有效成分柚皮素及其体内代谢产物可通过与脑神经元上的脑衰蛋白反应调节蛋白-2 结合，促进神经元的生长，改善阿尔兹海默症的症状。

该方法的优势在于进行目标识别时不需要对小分子进行任何的化学修饰，从而避免了繁琐的有机合成和因化合物空间结构改变带来的生物活性丢失，可用于确定其直接结合的蛋白靶点。此外，由于实验步骤中不包括洗涤，DARTS 可用于分析低亲和力物质之间的相互作用[22,23]。但是，利用Western blotting 或考马斯亮蓝染色来阐明配体与靶蛋白的相互作用过程中，当样品中目标蛋白丰度较低时，DARTS 法不易将目标蛋白可视化。

2.2 CETSA方案

CETSA方案由瑞典卡罗林斯卡学院的Dr.Martinez Molina 于2013年在Science 上首次提出。2014年，他在Nat Protoc 杂志上发表了详细的方案。CETSA 是研究细胞和组织中配体与蛋白质结合的一种新的生物物理技术，该方案的原理为小分子配体与靶蛋白质结合后可增加该蛋白质的热稳定性，导致该蛋白的溶解温度右移，即利用了配体诱导的靶蛋白的热稳定现象。将细胞或组织匀浆液与游离的小分子化合物直接孵育，然后进行热变性，变性的蛋白质通过离心去除。基于热稳定的原理，靶蛋白可耐受热变性而被保留在溶液中，随后采用western 印迹法对其进行检测。CETSA 与定量质谱法结合使用可系统地研究药物与细胞和组织样本中靶蛋白的结合，有望成为验证和优化药物靶点参与的重要工具[24]。

利用该方法可以检测配体与靶蛋白之间的相互作用，不需要任何额外的步骤即可利用完整细胞，是一种基于western blotting 和抗体对靶蛋白的高选择性的方法。适用于多种类型的蛋白质，但对于更大、更复杂的可溶性蛋白和膜蛋白的用途尚待确定。不过，该技术需要高浓度的药物，在发现新靶点的过程中明显通量不足，常被用于靶点的验证和确定[25]。

比如：林兵[26]对豆豉姜中的活性成分LC36抗类风湿性关节炎的靶点进行研究，首先通过大量文献研究构建了包含与该疾病有关的9 种蛋白质的靶蛋白库，然后将关键靶蛋白与活性成分进行对接分析，做靶点预测，最后通过CETSA 技术对预测的靶点进行验证，发现MEK1 和cathepsin 是LC36 抗类风湿性关节炎的作用靶点。Vasaturo 等[27]联合运用CETSA 技术与经典的生物化学方法，发现抗肿瘤活性药物冬凌草甲素与核仁素蛋白有直接的相互作用，该发现是首次表明小分子物质可结合核仁素蛋白并抑制其功能。陈香云[28]运用CETSA 技术对新藤黄酸的抗骨肉瘤效应进行探究，发现新藤黄酸通过靶向抑制USP9x（泛素特异性蛋白酶）的活性加速干细胞因子的降解，从而抑制肿瘤细胞的增殖，为靶向治疗骨肉瘤提供新思路。CETSA技术还广泛运用于茯苓酸抗胃癌的靶点研究、兔耳风天然产物Ainsliadimer A 的抗肿瘤靶点研究[29，30]等。

2.3 SPROX方案

SPROX 与DARTS 相似，是一种基于配体诱导靶蛋白稳定性的靶点识别方法。不同的是，SPROX 并不检测蛋白质的水解模式，而是测量目标蛋白的蛋氨酸氧化水平。其原理为当蛋白质库与小分子化合物一起孵育时，在化学变性剂盐酸胍存在下，通过控制其浓度来调节蛋氨酸的氧化速率，最后对蛋氨酸的选择性氧化速率进行定量研究，绘制非氧化产物和氧化产物与盐酸胍浓度的关系曲线，这两条曲线的交点即为迁移中点（C1/2 值）。由于配体结合蛋白稳定性增加，必须在相对高浓度的变性剂作用下才能得到相同浓度的氧化产物，所以具有比对照样品更大的转折中点。C1/2 值向较高变性剂浓度移动即表示该蛋白的配体诱导了其稳定，即可对比小分子探针与空白对照组的C1/2值来判断蛋白是否为特异性结合靶蛋白。

该方法无需大量纯化蛋白质，并且可以进行多重分析[31]。其不足之处在于，无法检测不含蛋氨酸的蛋白质与小分子的结合，同时，当蛋白质浓度较低时由于其氧化反应弱也不容易被检测到。因此，与DARTS和CETSA 方法结合使用，相互补充，更有利于小分子靶点的发现。

目前利用SPROX 方法对中药靶点的探究较少，DeArmond 等[32]利用该方法研究白藜芦醇的蛋白质靶标，发现除了之前已知的靶点胞质脱氢酶外，还有6个潜在的新蛋白靶点，其中四个与蛋白质翻译机制相关。考虑到该方案的错误发现率为2%-4%，研究者认为这6个新发现的潜在靶标仍需进一步的确认。

3 其它方法

由于药物-靶点相互作用鉴定的实验方法仍然是极其昂贵、耗时并具有挑战性的，因此除上述高通量直接筛选的方法外，还出现了大量间接识别天然产物靶点的方法。例如基于基因组学的RNA 干扰技术和CRISPR/Cas9 基因编辑技术、基于生物信息学的Connectivity Map（CMAP）生物数据 库和BATMANTCM在线分析工具等。

RNA 干扰技术利用shRNA 和siRNA 作为基因敲除工具，来验证小分子与靶蛋白的相互作用，同时对药物靶点的筛选也具有一定作用[33-34]。该技术与高通量方法结合极大增加了基因组学的应用范围，成为了识别小分子靶点的有力工具。

与RNA 干扰技术相比，CRISPR/Cas9 基因编辑技术能有效克服脱靶[35]。运用此技术对补骨脂活性成分补骨脂乙素进行了研究，发现其通过抑制二氢乳清酸脱氢酶的活性，实现对急性髓性白血病的细胞凋亡及分化的调节作用[36]。

生物信息学是计算机科学与信息处理相结合的一门综合性、创新性的学科。CMAP 是基于基因表达图谱的生物数据库，通过获取、对比并分析不同样本小分子的基因表达图谱，广泛应用于药物发现与预测作用机制等方面[37-38]。2017年以CMAP 数据库为基础，建立了首个国内关于天然产物小分子的基因表达图谱数据库，可用于预测靶点及小分子药理学活性[39]。Chao等[40]联用该数据库与CMAP发现丹参提取物丹参酮IIA的抗肿瘤作用靶点是PKCζ和PKCε。

BATMAN-TCM 是首个结合中药复方成分作用靶点与网络药理学分析的工具，汤化琪等[41]利用其预测了玄胡索散对骨关节炎的治疗作用靶点。

4 小结与展望

中药具有复杂的化学成分，并且配伍药物较多，经常是复方使用，药物作用的特点是多靶点、多层次以及多环节。其有效成分的靶点鉴定是一个复杂且耗时的过程，需要多层次、多角度相互佐证。探究小分子与靶蛋白的相互作用不仅可以找到潜在的药物作用靶标，而且能够对药物的机制和副作用有更深的了解。上述小分子靶点的探究方法都不能完全排除假阴性和假阳性的产生，而且在分离的过程中小分子的生物活性也会发生一定的改变，因此，阐述中药有效成分的生物活性及相应的靶标常需多种方法联合使用。相信随着检测技术的不断进步，将有力推进天然产物的研发并有助于对复杂中药体系的现代化阐述。