5hmC在癌症早期诊断中的应用

申嘉澍，李麟宛，董天雨

(1.北京大学公共卫生学院，北京 100000；2.北京大学城市与环境学院，北京 100000； 3.北京大学生命科学学院，北京 100000)

0 引言

随着遗传学研究的不断深入，科学家们发现了越来越多的肿瘤标志物，并尝试通过表观遗传学来研究癌症早期诊断[1,2]。5-羟基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine，5hmC)是哺乳动物DNA胞嘧啶碱基修饰，大部分位于DNA的转座子上，转座子的重复序列可损害基因组的功能和稳定性，当转座子的5hmC修饰减少时，转座子活性在细胞中被激活，易进而损伤DNA，诱发癌症[3,4]。近年来，随着高精确的质谱分析技术不断发展，对5hmC的检测技术不断进步，5hmC作为DNA修饰越来越受到重视。本文系统回顾了癌症早期诊断时5hmC作为肿瘤标志物的理论依据，总结了现有5hmC检测技术的特点及其局限性，并讨论了5hmC未来在癌症早期诊断方面的发展趋势。

1 新兴肿瘤标志物——5hmC

1.1 5hmC的生物学合成

早在1972年，5hmC就已经在成年大鼠、小鼠以及青蛙脑组织中发现，但当时并没有引起足够的重视，被认为是样品中氧化反应引起的DNA异常，因而未引起重视。直到2009年，先后两个研究发现5hmC在小鼠浦肯野细胞及小脑颗粒细胞中存在，从而引起学者的广泛关注DNA羟甲基化，即胞嘧啶向5hmC的转化。由5-胞嘧啶合成5-羟甲基胞嘧啶的关键分子是TET家族蛋白。哺乳动物DNA胞嘧啶复制后通过DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases，DNMT) 的作用，利用腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine，SAM)作为甲基供体，在胞嘧啶碱基5位上添加甲基，从而形成5甲基胞嘧啶。而活性DNA脱甲基化途径可通过TET酶(TET1、2和3)的活性来介导。TET酶是依赖Fe(II)和α-酮戊二酸(α-KG)的双加氧酶家族[5]。研究证明，TET酶能在培养细胞和体外通过铁和α-酮戊二酸依赖性方式的氧化催化5甲基胞嘧啶转换成5-羟甲基胞嘧啶[6,7]。此外，其他通路也与TET酶一起参与了羟基化至5hmC的过程。

1.2 5hmC在人体各细胞和肿瘤细胞中分布

早在1970年代，科学家就发现了人体中的5hmC，此后在各种组织和细胞类型中都发现了5hmC[8,9]。人体不同组织之间的5hmC含量有显著差异，这表明5hmC可以用作细胞或组织类型的标识符[10]。最近应用新研制的5hmC免疫学技术，确定了5hmC在人体组织中丰度，发现不同组织之间的5hmC含量有显著差异。脑组织中5hmC的含量最高(0.67%)，而直肠(0.57%)、肝脏(0.46%)、结肠(0.45%)和肾脏(0.38%)的含量次之。肺中的5hmC含量相对较低(0.14%)，胎盘中的5hmC含量更低(0.06%)，乳腺中的含量仅为0.05%[11]。研究发现在肿瘤细胞中5hmC修饰大量降低，除脑肿瘤外，与肿瘤周围的正常组织相比，在包括癌性结直肠组织、肝、肾、肺、骨骼肌、前列腺癌、乳腺癌和黑素瘤等实体瘤中，5hmC水平都降低了很多，甚至在结肠癌细胞中降低到无法检测的水平。其他研究人员通过显示不同类型实体瘤中5hmC的损失证实了这一观察结果[12,13]。5hmC分布的这种组织特异性，暗示了其潜在的用来诊断不同器官肿瘤的可能。

1.3 5hmc作为癌症早期诊断的生物标志物

来自患者血液的表观修饰5hmC可以作为人类疾病的早期诊断很有价值的生物标志物，因为其概括了相关细胞的基因表达变化。近年来，5hmC逐渐成为了癌症早期诊断的肿瘤标志物。研究表明，循环DNA中的5hmC标记可作为不同类型人类肿瘤的表观遗传标记[14-16]。针对前列腺癌和神经胶质瘤的研究显示，5hmC标记水平的降低与不良预后结局相关[17,18]。低水平的5hmC也是总体生存率和癌症复发时间的独立预后指标[19]。而临床试验显示，5hmC在非小细胞肺癌中联合表观遗传学诊断的效果优异[20]。这些实验研究结果是支持5hmC作为癌症筛查生物标志物的理论依据。

2 癌症生物标志物的特异性检测

2.1 传统组织活检与液体活检

肿瘤组织是鉴定癌症特异性生物标志物的金标准来源，也是现有癌症检测与诊断的最主要手段[21]。然而，由于组织活检具有侵入性和临床风险，所以组织活检具有一些局限。组织活检通常需要手术切除获得肿瘤组织，手术会带来出血和感染等风险[22]。除此之外，从单一区域组织活检获得的肿瘤信息具有空间局限性，且可能无法反映肿瘤内异质性[23]。相比之下，液体活检作为一种微创工具，在癌症治疗方面具有更大的优势。它采用循环物质如循环DNA、循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTC)和外泌体来检测指示癌症进展的分子变化，在临床上的应用潜力极大。

2.2 循环DNA在癌症诊断中的作用

循环DNA(circulating free DNA，cfDNA)是癌细胞在转移、死亡时，释放到患者血液中的DNA。通过检测循环DNA与癌症相关的遗传改变，如点突变，拷贝数变异，染色体重排和表观遗传畸变[24,25]，可以进行癌症的早期诊断。cfDNA的发现为临床带来了革命性的潜力[26]，cfDNA中的非侵入性生物标志物比组织活检具有实质性优势，因为它们可观测到肿瘤组织的完整遗传标记与表观遗传改变，特别是有助于检测肿瘤发生和发展的异常DNA甲基化过程[27,28]。而且，与现有的诊断和预后方法相比，cfDNA分析属于微创，没有肿瘤活检和潜在并发症风险，从而为困难或不安全的肿瘤活检提供了一种分子谱分析替代方法。

2.3 5hmC的检测

影响人类疾病中5hmC途径的机制作用仍待探究中，但是它们作为诊断标志物或治疗靶标的潜力已经得到了领域认可与理论支持。5hmC的传统检测方法为DNA甲基化检测方法。基于亚硫酸氢盐的全基因组测序和简并代表性硫酸氢盐测序(reduced representation bisulfite sequencing，RRBS)是甲基化分析的传统方法，并已应用于cfDNA的生物标志物发现[29]。然而，传统的检测方法并未将5mC与5hmC区别开。现阶段，高分辨率下绘制5hmC基因组分布图的创新技术不断发展，可用于5hmC的高效检测，例如单分子实时测序[30]，TET辅助亚硫酸氢盐测序[31]，氧化亚硫酸氢盐测序[32]和AbaSI偶联测序[33]。现有研究已经在单核苷酸分辨率下确定了5hmC在胚胎干细胞和大脑中的基因组分布[34]。作为一种重要的表观遗传标记，5hmC的超灵敏液体检测在生物医学领域具有极其重要的意义。但是，由于5hmC的含量较低，新发展的方法必须能够克服处理过程中样品损坏和损失的难题，此外，为了提高检测灵敏度，新发展的方法必须能够选择性富集和扩增5hmC DNA。从富集所得计数推断碱基分辨率级别5hmC修饰水平的统计方法可有助于增加对5hmC动态的了解。

3 5hmC在癌症诊断中的临床意义

3.1 5hmC与癌症表观遗传

随着生物学研究的深入，将5hmC与葡萄糖代谢和癌症表观遗传学联系起来，已有报道显示，cfDNA的全基因组5hmC动态变化对改善癌症管理具有临床意义。目前对5hmC生物标志物发现的研究主要集中在基因区域，这些cfDNA来源的5hmC生物标志物比传统的生物标志物具有更高的检测灵敏度[35]。已有科学家在组织特异性、癌症特异性的甲基化区域观察到了5hmC的显著富集[36]，因此，5hmC动力学的全基因组分析进一步完善我们对癌症和甲基化之间关系的理解。

3.2 5hmC在癌症诊断中的潜在应用

近年来随着生活环境变化，癌症发病率一直呈现上升趋势，发病年龄也趋于年轻化，因此，癌症早筛的意义越来越大。5hmC作为潜在的癌症生物标志物，在癌症患者的基因组中具有一定的分布与特征，这是5hmC作为癌症早筛标记的重要依据。已有研究表明，5hm C生物标志物在乳腺癌的诊断、分子亚型预测中的得到了初步应用[37,38]。5hmC表达水平的下降可以成为胃癌的特异性标志物，这在胃癌早期诊断与预后治疗中可发挥巨大潜力[39]。此外，在一组结肠癌患者组织研究中，结肠癌组织5hmC表达明显低于癌旁组织，其差异有统计学意义(P<0.05)[40]。由此可见，新型生物标志物5hmC在临床癌症诊断中可以发挥极大的潜力，是未来临床早癌筛查与癌症预后的潜在技术手段。

4 展望

表观遗传学的发展可为癌症早期诊断提供新思路，具有广阔的前景。当前的表观遗传学疗法在血液系统恶性肿瘤中已显示出良好的反应，在实体瘤中的诊断研究也在不断探索中。毋庸置疑，基于cfDNA的5hmC标记诊断法在癌症早期诊断中具有重要意义，但由于5hmC检测过程中存在着各种生物酶的序列依赖性，未来需要开发针对5hmC的酶促或化学转化方法，能够以单碱基分辨率针对特定位置的5hmC进行高分辨率检测。所以，特定于5hmC的替代化学转化方法进行肿瘤早期诊断预计会成为未来研究的重点。

此外，活细胞中5hmC的成像也是未来研究的发展方向。5hmC的成像对于实时监测5hmC在细胞生理和病理过程中的作用具有重要意义。但至今为止，细胞中5hmC的成像研究还很少。发展基于新型纳米材料(例如，金纳米粒子和半导体量子点)的生物传感器，有望突破活细胞中5hmC成像研究的瓶颈，完成5hmC的实时监测。