活动性结核病候选血清学诊断标志物的研究进展

李倩钰，徐鹏，陈玲

结核病是一种由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）所致的慢性传染性疾病。Mtb传染性强，主要经空气-飞沫传播，当结核病患者通过咳嗽等方式将病原菌排入空气并被他人吸入时，就有可能发生Mtb感染，但并非所有Mtb感染者会进展为结核病，多数Mtb感染者并不发病，该状态称为结核潜伏感染（latent tuberculosis infection，LTBI），仅有5%～10%的Mtb感染者疾病会进展为活动性结核病（active tuberculosis，ATB）［1］。ATB的发病部位通常在肺部（肺结核病），但也可能是其他器官（肺外结核病）。

我国作为结核病高负担国家，2020年WHO全球结核病报告显示，中国新发结核病患者约80万例，居全球第三位［2］。病原学诊断是结核病诊断的重要标准，然而目前我国结核病的病原学诊断正确率不到50%［2］。Mtb涂片方法相对简单，但诊断灵敏度不高，细菌培养虽是临床诊断结核病的“金标准”，但耗时长，且只能检测活菌［3］；基于分子诊断的利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术快速、灵敏度高，但检测成本高，因此临床应用受限［4］。另外，病原学检查均需要痰液、病灶组织等样本，对于不易获得样本的肺外结核病或无痰患者以及痰菌学检查阴性或菌量无法达到检测阈值的ATB患者存在局限性［5］。因此，多数结核病患者依赖于影像学检查、医生的临床经验及血清学检查进行诊断，其中影像学检查受医生临床经验的影响较大，较为主观，易造成误诊、漏诊。

基于诊断标志物的免疫血清学方法有望成为弥补病原学和影像学诊断不足的一种ATB的有效诊断方法，其兼顾快速和准确性。在目前的检测方法中，结核菌素皮肤试验（tuberculin skin test，TST）存在与包括卡介苗（bacille de calmette guerin，BCG）在内的其他分枝杆菌的交叉反应，特异度较低；γ-干扰素释放试验（interferon gamma release assays，IGRAs）是一种新型体外T细胞免疫检测试验，可有效诊断Mtb感染，具有较TST更高的灵敏度和特异度，但无法鉴别诊断ATB与LTBI［3，6-11］，上述血清学检测方法的问题均在于诊断标志物的特异度和/或灵敏度不高。因此，寻找可靠的诊断标志物，对于建立有效的ATB血清学检测方法非常关键。故本文对抗原、抗体、细胞因子及miRNA等候选血清学标志物诊断ATB的价值进行综述。

1 ATB候选血清学抗原、抗体标志物

机体在感染Mtb后可首先产生Mtb抗原，因此ATB患者病灶内Mtb不断繁殖、播散，进而产生大量的Mtb抗原，反复刺激机体B淋巴细胞分化成浆细胞，进而产生特异性抗体［3］，包括免疫球蛋白（Ig）E、IgG和IgM等，而特异性抗体水平可能与致病菌载量有关。IgG是人体体液中分布最广泛的一种抗体，成为抗体检测的主要指标。目前酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）已广泛用于血清学标志物的检测［9，12］。

1.1 ATB主要特异性抗原标志物

1.1.1 38 kD蛋白 38 kD蛋白是目前被研究较多的一种Mtb抗原，其是细胞膜的组成成分，参与磷酸盐转运，含有特异性的B细胞和T细胞抗原决定簇，可诱导早期免疫反应［13-14］。有研究表明，38 kD蛋白鉴别诊断ATB与LTBI的灵敏度为50.0%，特异度为95.5%［2］；另有研究表明，38 kD蛋白鉴别诊断ATB与LTBI的灵敏度为74.7%、特异度为69.4%［15］。综上，38 kD蛋白具有潜在的诊断价值。

1.1.2 MPT32（Rv1860） Mtb的B细胞抗原MPT32（Rv1860）是富含丙氨酸和脯氨酸的Mtb分泌蛋白，具有纤连蛋白的结构域。MPT32（Rv1860）可诱发细胞免疫反应，是由Mtb分泌的主要抗原，在免疫系统清除Mtb的过程中具有重要作用。PATHAKUMARI等［3］用MPT32检测ATB患者与健康人群的血清抗体水平，结果显示，MPT32抗原诊断ATB的灵敏度、特异度分别为38.89%、95.56%，推测MPT32（Rv1860）有望成为ATB的诊断标志物。

1.1.3 Ag85复合物除 38 kD蛋白、MPT32（Rv1860）外，Mtb分泌蛋白的主要成分还包括Ag85复合物，其是由Ag85a、Ag85b和Ag85c组成，对纤维连接蛋白具有高度亲和力，并具有维持细胞壁完整性的分枝酰转移酶活性的作用［16-17］。其中Ag85a（Rv0934c）是一种具有免疫优势的抗原，可诱导机体产生强烈的细胞免疫反应，促进巨噬细胞的杀伤作用［18］。有研究表明，Ag85a抗原检测ATB的灵敏度为33.33%，特异度为 95.56%［2］。

1.2 ATB其他特异性抗原标志物 针对ATB诊断性抗原候选标志物的筛选一直是结核病诊断研究的重点。一项研究比较ATB患者与LTBI者血清，其通过Mtb抗原免疫原性的研究，利用4 262个Mtb蛋白质制备芯片筛选并发现了3个具有ATB潜在诊断价值的Mtb抗原——Rv1408、Rv2031c和Rv2421c，其中Rv2031c是一种毒素和抗毒素相关蛋白，Rv1408参与硝酸盐/亚硝酸盐代谢，而Rv1408、Rv2421c均参与Mtb的中间代谢和呼吸过程［19］。另一项关于ATB诊断标志物的研究首先从4 000多个Mtb蛋白中初步筛选出100个具有潜在诊断价值的Mtb蛋白，然后制备微蛋白芯片，并比较ATB患者、LTBI者和健康人群血清中抗原，最终筛选出5个具有ATB潜在诊断价值的抗原——MT1560.1、Rv0049、Rv0270、Rv1597和Rv3480c［20］，其中Rv0270是长链脂酰辅酶A连接酶D2（long-chain fatty Acyl-CoA ligase D2，FadD2）相关蛋白［21］，在Mtb脂质代谢过程中发挥重要作用，有利于潜伏感染期间Mtb的生存；Rv3480c是一种甘油二酯酰基转移酶，是一种Mtb分泌蛋白，可能参与了Mtb休眠状态下的能量供应［22-24］。这些研究所筛选出的ATB潜在诊断抗原，并未出现相同抗体，这可能是由于Mtb菌株差异或人群遗传、背景差异导致的免疫水平差异，且上述抗原是否可应用于临床检测还需要不同地区更多的临床数据进行研究。

1.3 ATB主要特异性抗原标志物的联合应用 有研究结果显示，相比健康人群，结核特异性抗原38 kDa蛋白、MPT32（Rv1860）和Ag85a复合物联合检测ATB患者的血清抗体IgG表达水平均升高［3，25］。38 kD 蛋白、MPT32（Rv1860）和Ag85a复合物诊断ATB的特异度均较高，但灵敏度低［9］，推测上述抗原联合检测的效果可能更好。有研究显示，38 kD蛋白联合MPT32（Rv1860）鉴别诊断ATB的灵敏度为68.0%，特异度为92.2%；而38 kD蛋白、MPT32（Rv1860）及Ag85a复合物联合鉴别诊断ATB的灵敏度为71.1%，特异度为 88.8%［3］。可见 38 kD 蛋白、MPT32（Rv1860）及Ag85a复合物联合诊断ATB的灵敏度更高，但并未明显提高特异度。

2 其他ATB候选血清学标志物

2.1 微小RNA（microRNA，miRNA）候选标志物 研究发现，miRNA是一种单链非编码的小分子RNA，参与机体包括早期发育、细胞增殖、细胞凋亡、代谢（包括脂肪酸代谢、糖代谢和氨基酸代谢多个关键代谢途径）等一系列过程［2］。多项研究表明，miRNA参与调节Mtb感染的炎症过程［6，26-28］。有报道发现，miR-29a可通过靶向作用Caspase 7通路来影响感染Mtb的巨噬细胞的凋亡［29-30］；miR-26a-5p被证明可通过作用于Kruppel-like转录因子4来调节巨噬细胞极化和Mtb向溶酶体的转运［30］；miR-27b可导致巨噬细胞向泡沫细胞转化，进而影响Mtb患者的生存［30］。这些研究提示miRNA与Mtb在宿主体内活动有关，对宿主miRNA表达产生影响。

FU等［26］通过miRNA芯片检测ATB患者、LTBI者与健康人群的血清miRNA表达水平，结果显示，miRNA在ATB患者中呈高表达，且miR-29a诊断ATB的灵敏度为83.0%，特异度为80.0%；此外，miR-29a在ATB患者痰液中也呈较高表达；与健康人群相比，ATB患者血清、痰液miR-29a表达水平分别增高11.9倍、5.2倍。ALIPOOR等［31］研究表明，ATB患者miRNA水平与细菌载量有关。另有研究表明，ATB患者血清miR-93、miR-144、miR-196b、miR-361-5p、miR-365表达水平升高，miR-518a、miR-520a、miR-526、miR-221表达水平降低［32-38］。但miRNA对ATB是否具有诊断价值仍需进一步研究验证。

2.2 细胞因子候选标志物 细胞因子是检测感染性疾病的重要手段。在结核病领域，基于检测干扰素（interferon，IFN）-γ的IGRAs方法，可有效诊断Mtb感染，但无法区分LTBI与ATB。但机体在感染Mtb后释放的细胞因子除IFN-γ外，还有白介素（interleukin，IL）等其他具有免疫调节功能的细胞因子，其均有望成为诊断ATB的标志物。

国内研究显示，ATB患者血浆IL-8、干扰素诱导蛋白10（interferon-inducible protein-10，IP-10）、巨噬细胞炎性蛋白1α（macrophage inflammatory protein 1α，MIP-1α）、可溶性白介素2受体α（soluble interleukin-2 receptor α，sIL-2Rα）和抗原刺激后IL-8、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、单核细胞趋化因子3（monocyte chemotactic protein-3，MCP-3）水平高于LTBI患者及健康人群，上述指标预测ATB的ROC曲线下面积（area under curve，AUC）分别为0.80、0.86、0.75、0.85、0.83、0.81、0.75，均具有一定诊断价值［39］。另有研究发现，受Mtb的Rv0183蛋白刺激后人全血分泌的IL-6同样具有诊断价值，其在ATB患者中的表达水平高于LTBI患者、健康人群，其预测ATB的特异度和灵敏度均超过80%［39］。

IL-37是IL家族的新成员［40-43］。ATB患者体内Mtb可大量繁殖，机体巨噬细胞在识别该病原菌后可释放大量IL-37，而IL-37过表达可抑制巨噬细胞分泌活性，进而发挥促进炎症的作用，还可诱导调节T淋巴细胞和破坏效应T淋巴细胞功能［42-44］。研究表明，与健康人群相比，ATB患者血清IL-37水平明显增高，且IL-37水平与ATB相关［42］；另有研究发现，高水平IL-37与咳嗽、发热等结核中毒症状相关［44］。

3 小结与展望

全球LTBI患者约有20亿，其中5%～10%患者在感染后2～5年发展为ATB［1］。一般情况下，ATB患者局部组织炎症反应程度可随细菌载量增加而加重，肺部病变更易形成空洞，进而发展为具有高度传染性的空洞性肺结核。因此，准确诊断ATB对于治疗和控制结核病尤为重要。血清学诊断结果客观，不易受医生临床经验的影响，灵敏度和特异度均较高，且取材方便、检测快速，较适用于不易获取样本的肺外结核患者及体内菌量无法达到检测阈值的ATB患者。此外，血清学检测可提高ATB的诊断率。目前血清学诊断仍是结核病检测方法相关研究的热点，抗原、抗体、miRNA及细胞因子均有其自身的特点，将是今后血清学检测探索的方向。

作者贡献：李倩钰进行文章的构思与设计，文章的可行性分析，文献/资料收集、整理，撰写论文；李倩钰、徐鹏进行论文及英文的修订；陈玲负责文章的质量控制及审校，并对文章整体负责、监督管理。

本文无利益冲突。