环状RNA与代谢性疾病研究进展

杨 旭，张致英，康龙丽，马利锋

(西藏民族大学环境与疾病相关基因研究高校重点实验室，陕西 咸阳 712082)

代谢性疾病指体内多种营养性物质代谢异常，这些异常在多种疾病如糖尿病、高血压、肥胖、心血管疾病和肿瘤等疾病的发生与发展中起着关键作用[1]。随着人们生活质量的逐步提高和饮食结构的调整与丰富，代谢性疾病发生的危险也相应提高。有研究报道，环状RNA(Circular RNA，circRNA)的代谢失调是导致机体代谢紊乱的主要原因之一，其参与了如糖尿病和心血管疾病等多种代谢性疾病的发生[2]。

1 circRNA的一般特征

在20世纪70年代，有研究者在植物类病毒中首次发现了circRNA，但由于当时知识的局限，研究者们把它误以为是异常剪接的产物(亦称为剪接“垃圾”)而没有足够重视，直到后来在真核细胞中发现了广泛表达的circRNA[3]，这才引起人们的广泛关注。大多数circRNA是由已知蛋白质编码基因表达的，由一个或多个外显子通过异常的反向剪接方式形成一个共价闭合环形结构[4]。其实circRNA和大多数线性RNA一样，具有高度的进化保守性，还包括种属、组织和疾病在内的特异性[5]。与线性RNA不同的是，虽然circRNA不具有5’末端帽子结构和3’末端多聚腺苷酸尾(poly-A)结构，但是它的稳定性高于线性RNA，这可能与闭合环状结构受到外切酶的保护有关[6]。另外，这种异常反向剪接的效率要比线性剪接低得多[7]，但是在某些情况下circRNA的丰富度要高于线性RNA[8]。根据circRNA组成序列的不同，可将其细分为位于细胞质的外显子circRNA[9]、位于细胞核的内含子circRNA[10]以及具备两者的位于细胞核的外显子-内含子circRNA(EIciRNA)[11]。但是一般来说circRNA主要位于细胞质[12]，可能存在小RNA(miRNA)反应元件(MREs)[MREs指miRNA通常根据mRNA的3’-非翻译区(3’-UTR)上特定位置的序列互补结合它们的mRNA靶点]。总体说来，circRNA可以概括为以下几大特征：①绝大多数circRNA是非编码RNA；②circRNA比线性RNA更稳定；③在某些情况下，circRNA的丰富度要高于其他相应的线性mRNA；④circRNA在不同物种之间具有高度的进化保守性和种属、疾病与组织特异性；⑤绝大多数circRNA主要位于细胞质，可能具有MREs。

circRNA的形成机制可以概括为内含子配对驱动的循环化、RNA结合蛋白(RBP)驱动的循环化和套索驱动的循环化三种机制。①内含子配对驱动的循环化：主要成分是顺式作用元件(短的非编码调控序列)，位于反向剪接外显子的侧翼内含子中，能够在侧翼内含子之间进行直接的碱基配对[13]。②RBP驱动的循环化：反式作用因子(结合顺式作用元件的蛋白质)识别并停留在位于环状外显子两侧的内含子上的特定基序上，通过蛋白质-蛋白质相互作用或这些RBPs的二聚体参与反向剪接反应。虽然内含子配对驱动的循环化和RBP驱动的循环化这两种机制不同，但可能是一起工作的[14]。③套索驱动的循环化：指在线性剪接过程中形成circRNA的过程。这些circRNA可能来源于在pre-mRNA剪接中内含子的去除或起源于外显子跨越。

2 circRNA的功能

近年来，随着高通量测序技术和生物信息学的迅速发展，circRNA在真核生物体内发挥了重要的生物学功能。

2.1 miRNA海绵 circRNA可以作为miRNA的“海绵”发挥作用。所谓海绵作用，指circRNA可以竞争miRNAs并与它们的MREs结合[15]，通过与靶向mRNA 3’-UTR进行碱基互补配对，miRNAs可以阻止靶向mRNA的翻译，从而影响靶向mRNA的稳定性。值得注意的是，这里仅仅指的是外显子circRNA能发挥海绵作用，而内含子circRNA与miRNA结合位点比较分散，所以不能发挥海绵作用[16]。有研究[17]表明，在骨关节炎中反义小脑变性相关蛋白(CDR1as)的表达水平显著上调，与miR-641的表达呈负相关，这是因为CDR1as直接靶向结合miR-641充当其海绵竞争结合MREs。但并不是所有的circRNAs都可以作为miRNA“海绵”来发挥作用的，如脑源性circRNA并不表现出比其相应的线性mRNA更大的能力作为miRNA海绵[18]。所以circRNAs的海绵作用在生物体内得不到大范围的推广，其具体的海绵作用机制还需要进一步深入的研究。

2.2 circRNA与RBP相互作用 随着人们对circRNA功能认识的增加，发现RBPs对circRNA的影响尤为突出。通过RBP驱动的循环机制可知，circRNA生物学功能可以受到RBP的调控。RBP可以与circRNA相互作用，并在circRNA剪接、复制、折叠、稳定和定位中发挥作用。有研究[19]报道，Argonaute蛋白(Ago)家族功能是RNA沉默过程中的核心因素，可以与不同类别的小非编码RNA包括miRNA结合起来参与mRNA的切割或翻译抑制。circRNA之所以能发挥海绵作用，可能是由于许多circRNA通过充当Ago2和miRNAs的结合平台，降低了miRNA与靶向mRNA结合的能力。Ago2可以作为RBP参与circRNA功能的典型代表。也有研究[20]报道，HuR是一种著名的RBP，保持了许多靶向mRNA的稳定性，包括PABPN1 mRNA。研究[21]发现HuR对circRNA的稳定性没有必要，但能与circPABPN1结合。circRNA可以比它们相应的线性RNA更稳定，且具有更复杂的转录调控过程。RBP被证明参与了circRNA翻译过程，其中m6A内部修饰是哺乳动物mRNA中普遍存在的反转甲基化。虽然circRNA还含有丰富的m6A修饰，但这还不足以参与蛋白质翻译。

另外有研究发现，在乳腺癌细胞系MDA-MB-231中，大多数circFoxo3与另一组蛋白质MDM2和p53密切相关。通过与MDM2和p53结合，circFoxo3可以促进p53的泛素化和降解，导致乳腺癌细胞系p53下降。由于circFoxo3MDM2复合物诱导，Foxo3与circFoxo3具有低亲和力结合，防止了Foxo3泛素化和降解，导致Foxo3蛋白水平升高，诱导细胞凋亡[22]。这表明特定的蛋白质可以与不同的circRNA结合，而某些circRNA对不同的RBP也具有动态亲和力，不是一成不变的。

2.3 转录调控与翻译 circRNA除了具有作为miRNA的海绵作用和与RBP相互作用外，还能在生物体内发挥转录调控的功能。目前已有研究发现circTP63在肺鳞状细胞癌组织中被上调，其上调与患者的肿瘤大小和TNM分期有关。circTP63的异常增高能促进体内和体外细胞增殖。FOXM1被认为是circTP63的主要候选靶点。当circTP63基因敲除时会显著降低FOXM1 mRNA和蛋白水平，而circTP63过表达时观察到相反的结果。此外，circTP63可竞争性地与miR-873-3p结合，阻止miR-873-3p降低FOXM1水平，从而上调CENPA和CENPB(细胞周期相关基因)，最终促进细胞周期的进展[23]。虽然在真核生物体内circRNA不能与核糖体结合翻译蛋白质，但是有研究发现在小鼠体内的circZNF609可以翻译蛋白质。这可能是由于circZNF609包含一个从起始密码子和终止密码子的开放阅读框(ORF)参与circRNA循环化的形成机制，其发生过程与线性转录基本一致。

3 circRNA与代谢性疾病的潜在关系

代谢性疾病是由于体内一些物质代谢异常，引起高血压、糖尿病、肥胖症、心血管疾病和癌症等。随着人们对circRNA的深入研究，发现其在代谢病的发生、发展中起着重要的作用，很容易在血液、血清、尿液、精液或其他体液中检测到[24]，circRNA已经成为RNA领域研究的热点。最重要的是，circRNA已经成为多种代谢性疾病的潜在生物标志物并为疾病的预防和治疗提供了新的策略。

3.1 高血压 高血压是一种在世界各地人群中常见的慢性疾病，是成人心血管发病率和病死率的主要原因之一。在高血压患者的各种组织和体液中可以检测到circRNA的异常表达，如在对100例原发性高血压(EH)患者的病例对照研究中发现多达287种circRNA在高血压患者的全血中表达，包括209个上调和78个下调的circRNA。另外，与健康者相比，hsa_circ_0037911在EH患者显著升高，这可能是hsa_circ_0037911通过充当海绵来抑制miR-637活性，从而促进了EH的发病[25]。另外有研究发现hsa_circ_0014243在EH患者血液中的表达水平也增加，这可能是hsa_circ_0014243作为hsa-miR-10a-5p的特异性海绵在EH中发挥功能[26]。hsa_circ_0037909在EH患者中的表达水平显著高于健康对照组，其可能影响血清肌酐或低密度脂蛋白，进而导致EH的形成，因此可能是早期诊断EH的重要生物标志物。

3.2 糖尿病 糖尿病(DM)是一种常见的内分泌代谢紊乱性疾病，其特点是由于胰岛素分泌作用缺陷和(或)外周胰岛素抵抗而导致的慢性高血糖[27]。其中影响患者生存率最大的威胁就是糖尿病的微血管并发症如视网膜病变等。对此，目前的治疗水平是非常有限的，寻找新的反映或预测个体胰岛素分泌功能障碍的新标志物来预防和治疗糖尿病的微血管并发症是至关重要的。有研究[28]发现，在糖尿病患者外周血中circRNA与正常对照组比较有统计学差异，其中最显著上调的是hsa_circ_0054633。circRNA也参与威胁糖尿病患者生命的主要并发症，如：在糖尿病患者的视网膜病变中circHIPK3显著升高，而circHIPK3的敲除减轻了视网膜病变；circ_0005015沉默显著降低了视网膜血管内皮细胞的增殖、迁移和血管的生成，这可能与circ_0005015作为内源性miR-519d-3p海绵抑制其活性有关，而circ_0005015可能是监测糖尿病视网膜病变的理想候选生物标志物。另外，过度表达的cPWWP2A通过抑制miR-579的表达来发挥作用的circRNA也能够减轻糖尿病引起的视网膜血管功能障碍。

3.3 肥胖症 近年来随着人们生活方式和饮食习惯的改变，肥胖患者的数量日益增多。肥胖已经成为多种疾病的主要危险因素，包括糖尿病、心血管疾病、高血压、冠心病和某些类型的癌症。circARF3作为内源性miR-103的海绵，通过促进线粒体吞噬减轻脂肪炎症(导致肥胖发生的重要原因)来预防肥胖。研究[29]发现，孕产妇肥胖会导致后代患上代谢紊乱和肥胖，可通过circRNA_0000660_miR_693-Igfbp1的调节途径来调控机体靶基因的表达以影响后代的脂质代谢，从而预防代谢紊乱和肥胖的发生。最近有研究[30]报道肥胖患者的认知性痴呆就是高脂饮食引起的。在高脂饮食条件下喂养的小鼠，在大脑皮质中发现与神经发生突触和钙信号的有关circRNA表达水平发生了很大的变化。另外也发现了很多非编码RNA的表达如circRNA，这为高脂饮食引起肥胖的认知性痴呆机制的后续研究奠定了基础。

3.4 心血管疾病 随着人口老龄化数量的增多，心血管疾病的患病率和病死率日益增加，已经成为全球死亡人数最多的疾病之一，迫切需要确定新的治疗靶点和生物标志物。研究发现在心力衰竭患者的外周血中存在差异表达的circRNA，其中有29个上调和27个下调。hsa_circ_0097435显著上调会促进心肌细胞凋亡，而沉默会出现相反的结果，它还能通过海绵化多个miRNA在心衰中发挥作用，可能成为心衰患者的潜在标记物和新兴治疗靶点。也有研究发现，hsa_circ_0007623在缺氧诱导的人脐静脉内皮细胞中高度表达，并可以充当miR-297的海绵，而miR-297在急性心肌缺血后参与心脏修复。生物信息学分析发现hsa_circ_0007623和miR-297可以直接靶向血管内皮生成因子(VEGFA)，抑制hsa_circ_0007623的表达，减少细胞增殖、迁移和血管生成。功能实验表明，hsa_circ_0007623沉默可上调miR-297并下调VEGFA，促进心肌缺血后心脏的修复和保护心功能。circMACF1是miR-500b-5p的直接靶标，通过调节miR-500b-5p/EMP轴来阻止心肌梗死的进程，可能是治疗心肌梗死的潜在靶标[31]。内皮炎症是导致冠状动脉粥样硬化的一个重要因素，circRELL1可以与细胞质中的miR-6873-3p结合，直接消除miR-6873-3p对炎症反应的抑制作用，表明circRELL1可以成为冠状动脉粥样硬化所致内皮炎症的一个治疗候选标志物。

3.5 肿 瘤 circRNA在肿瘤的发生和发展进程中发挥着重要的作用。研究发现circCCDC66在胃癌组织和细胞中显著表达，其表达的上调与肿瘤分期和淋巴转移相关。如果把circCCDC66敲除，会显著抑制癌细胞的增殖、迁移、侵袭，诱导胃癌细胞凋亡，使其过表达则会有相反的结果。此外，circCCDC66通过激活胃癌细胞中的c-myc和TCF-β信号通路来促进胃癌的生长和转移，可能成为胃癌诊断潜在的生物标记物。另有研究发现circRBM33的表达与胃癌的临床特征密切相关，使circ-RBM33沉默会使胃癌细胞的凋亡增加，而癌细胞的增殖、迁移和侵袭减少，其机制是circRBM33通过circRBM33/miR-149/IL-6的靶向轴来控制胃癌的发生和发展。

宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，由于手术、药物和放射治疗不能取得满意的效果，其治疗一直是一个难以解决的问题。研究发现circSLC26A4在宫颈癌组织中高度表达，若将其敲除则会抑制体内癌细胞的增殖、侵袭和肿瘤生长。此外，circSLC26A4可以充当miR-1287-5p的海绵，使miR-1287-5p靶向结合HOXA7mRNA的3’-UTR。QKI(一种RBP)可与SLC26A4基因的内QKI反应元件相互作用而促进circSLC26A4的表达，而circSLC26A4可通过QKI/circSshuiLC26A4/miR-1287-5p/HOXA7轴促进宫颈癌的发展。在宫颈癌患者的血清中，circFoxo3a的表达水平显著降低，与更深的基质浸润和淋巴结转移阳性高度相关，能够更好地反映患者的预后。

前列腺癌是男性生殖系统肿瘤之一。circ_KATNAL1可与miR-145-3p直接结合抑制癌细胞的增殖、侵袭和迁移，但在前列腺癌中被下调。在许多肿瘤中高度表达的WISP1(是miR-145-3p重要的靶基因)与前者的作用相反。研究[32]表明circ_KATNAL1通过miR-145-3p/WISP1在前列腺癌中发挥抗癌作用。circITCH在前列腺癌细胞和组织中的表达显著降低，其过表达可抑制前列腺癌的恶性表型。此外，miR-17-5P的表达水平与circITCH呈负相关，而HOXB13的表达与circITCH呈正相关，这可能是circITCH充当了miR-17-5P的海绵来增加HOXB13基因表达的结果。

4 结 语

近年来，人们对circRNA形成过程和功能有了进一步的认识，但是也存在一些局限性。单纯就海绵作用而言，真正可以在真核生物体内作为miRNA海绵来发挥生物学功能的circRNA数量是有限的，得不到大规模的应用；circRNA与miRNA结合后是否一定抑制miRNA的功能，circRNA 是否与miRNA竞争结合的mRNA存在一一对应的关系以及相关的作用机制，我们还不是很清楚；虽然circRNA参与大多数代谢性疾病的发生与发展，但是对miRNA海绵作用的研究居多，对其他方面机制和功能的探索还处于起始阶段，circRNA与疾病之间具体的致病机制还是未知的，这也是我们研究疾病的另一个切入点。今后，我们可以从circRNA除海绵作用之外的其他功能方面去对疾病的具体发病机制进行更加深入的研究。