毛竹笋在快速生长期的木质化调控网络

李紫阳 杨克彬 高志民

(国际竹藤中心 北京 100102)

随着城市化、工业化和社会经济的发展，对不可再生化石材料的需求不断增加，开发利用非木材生物质资源成为必然。竹子因其产量高、生长周期短而成为一种具有应用前途的木质纤维素原料，同时优异的机械和拉伸强度以及弹性，使其成为木材的良好替代品。竹材的力学性能在很大程度上取决于纤维细胞壁的木质化程度，而木质素的合成和沉积则伴随着次生细胞壁(SCW)的形成。木质素的含量和分布是竹材具有优异力学性能的基础，也是竹材加工工艺的重要基础。因此，全面解析竹材木质素生物合成的调控网络，制定切实可行的策略调控竹材木质素组成，不仅有助于提高竹材的力学性能，而且对竹材资源的开发利用有重要意义。

木质素是一种芳香族细胞壁聚合物，其含量在维管植物中仅次于纤维素，它主要沉积在加厚的次生细胞壁中，对于机械支持、胁迫响应和木材的形成是不可或缺的。木质素的生物合成是通过苯丙氨酸解氨酶(PAL) 将苯丙氨酸脱氨形成肉桂酸，经过各种酶的催化，最终由漆酶(LAC)和过氧化物酶氧化形成木质素聚合物。目前，在木质素生物合成的遗传调控网络中鉴定出大量NAC、MYB 和其他转录因子家族的成员，它们进一步调节下游的酶基因。此外，在这个网络中这些遗传因子还受到许多miRNA 的靶向调控。研究表明，水稻木质素生物合成的多个遗传因子(miRNA 和转录因子) 调控木质素生物合成相关酶基因的表达。然而，单子叶植物中涉及miRNA、转录因子和酶基因的完整分级调控木质素合成的网络仍处于空白。目前，在竹种Boniaamplexicaulis、Guadua angustifolia、Olyra latifolia和Raddia guianensis中，参与竹木质素生物合成途径的酶基因分别有54、39、26 和33 个，然而对于毛竹木质素生物合成的遗传调控网络仍然缺乏全面了解。

1 材料与方法

1.1 植物材料

2018 年4 月，于江西南昌野外毛竹竹林中取样。取5 个不同高度 (1.0、2.0、4.0、6.0 和8.0 m) 笋的第13 节间的上、中、下部为实验材料。样品立即冷冻于液氮中，－80 ℃保存，用于RNA 提取和酶活性测定。同时，相同的2 份样品分别用FAA 固定液固定和烘箱干燥后用于切片观察和木质素含量测定。样品名称被定义为‘笋－高度－部位’，例如，S－2－T、S－2－M 和S－2－L 分别代表2.0 m 笋的第13 节间的上部、中部和下部。此外，S－1 代表1.0 m 笋的上中下3 部分的混合样本。

1.2 木质素含量的组织化学染色和酶活性测量

参照文献实验方法，将存放于FAA 固定液中的笋样品进行切片并用甲苯胺蓝染色观察。干燥的笋样品充分研磨并过40 目筛后使用乙酰溴法进行木质素含量测定。此外，取存放于－80 ℃冰箱的笋样品(0.1 g) 与缓冲液中充分研磨至匀浆，在4 ℃条件下13 000 rpm 离心15 min 后，收集上清液，并使用试剂盒进行酶活性测定。

1.3 RNA 提取、文库构建、RNA-seq、miRNA和降解组测序

使用TRIzol 法提取13 个样品的总RNA 用于转录组、miRNA 和降解组测序，进行3 次生物学重复，使用Agilent 2100 分析仪和NanoDrop 2000检查总RNA 的质量和纯度，在BGISEQ-500 平台上对文库进行测序。运用NOISeq 软件包鉴定筛选DEG，标准为差异倍数≥2 和偏离概率值≥0.8。利用基于R 语言的GOseq 包进行GO 富集分析，识别GO 功能类别。利用KOBAS 软件进行KEGG通路富集分析。

1.4 qPCR 验证差异基因和差异miRNA

为了验证测序得到的miRNA 和基因的表达趋势，使用Primer Premier 5.0 软件根据候选基因和miRNA 序列设计特异性引物，使用SYBR Green Master Mix 在qTOWER 荧光定量PCR 仪进行实时荧光定量PCR。分别使用PeNTB和U6snRNA 作为基因和miRNAs 的内参基因。扩增程序为:95℃10 min，95 ℃10 s，62 ℃10 s，40 个循环，采用2－ΔΔCT法分析基因的相对表达量。

1.5 酵母单杂测定

将PeMYB20/85.2、PeMYB103.3和PeMYB4.1的编码序列(CDS) 重组到pGADT7-Rec2 载体中，并将3 个AC 元件、3 个SMRE 元件以及PeLAC20启动子序列构建到pHIS2 载体中。将重组载体共转化Y187 菌株，转基因植株在添加20 mM 3-AT的缺陷培养基上培养3 d。

1.6 凝胶迁移实验(EMSA)

使用化学发光EMSA 试剂盒(Beyotime，中国) 进行EMSA 实验。在探针两端用生物素标记含有AC 元件的PeLAC20启动子片段作为探针，标记探针与纯化的PeMYB4.1 和PeMYB20/85.2蛋白在25 ℃孵育1.0 h，在0.25×Tris/Borate/EDTA 缓冲液中用6%天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 分离，以未用生物素标记的作为竞争探针。

1.7 PeLAC20 植物表达载体的构建及转化

以毛竹基因组DNA 和cDNA 为模板，从毛竹中扩增出PeLAC20的CDS 序列和2 000 bp 的启动子序列，将PeLAC20的CDS 重组到pCAMBIA1301载体上。利用GV3101 菌株介导的花浸渍法将重组载体转化到拟南芥(Col-0) 植株中。

1.8 转基因拟南芥植株的筛选及功能验证

用含50 mg/L 潮霉素的MS 培养基筛选PeLAC20的转基因植株，并进行RT-PCR 验证。分别用乙酰溴化法和1% (v/v) 的间苯三酚对转基因和野生型拟南芥6 周龄幼苗的茎进行了木质素含量分析和组织学染色，使用光学显微镜(Olympus CX31，日本东京) 拍照观察。

2 结果与分析

2.1 竹笋快速生长过程中的形态和理化变化

对不同高度毛竹笋的代表性节第13 节间进行组织化学染色分析表明，随着竹笋高度增加，维管束染色细胞数量增加且染色加深，表明竹笋的生长木质化程度逐渐增加。笋的木质化程度在1.0 m 和2.0 m 之间几乎不变，但在2.0 m 到4.0 m 之间木质化程度急剧加深，之后其木质化程度持续加深。在较成熟笋的上部、中部和下部木质素含量分别显著高于较幼嫩笋的相应部分(p<0.01)。1.0 m 到4.0 m 笋上部木质素含量高于中部和下部，而6.0 m 笋的上部、中部和下部的木质素含量基本相同，各部位的木质素含量差异不显著，然而快速生长后期的笋即8.0 m 笋，其木质素含量最高的是下部(122.67 mg/g)，其次是中部和上部(99.40 和90.78 mg/g)，这与组织化学染色的结果相一致。

PAL 和LAC 是木质素合成和聚合的2 个关键酶，因此对不同高度笋中PAL 和LAC 的酶活性进行检测。1.0 m 和2.0 m 笋相较于较高笋中的PAL 活性较低，而4.0 m 笋的PAL 活性显著高于2.0 m 笋，提高了2 倍。与6.0 m 笋相比，8.0 m笋中3 个部位的PAL 活性均呈下降趋势，且在上部下降幅度的最大。与1.0 m 笋相比，2.0 m 笋的LAC 活性急剧上升，6.0 和8.0 m 笋LAC 活性基本相同，但8.0 m 笋LAC 活性相较于6.0 m 笋略有下降。这些结果表明，同一节间3 个部位的木质化程度不一致，但随着笋高度的增加，木质化程度均逐渐加深。

2.2 参与到笋木质化过程中的DEG 的鉴定

通过测序，13 个样本共产生441 803 万raw reads，其中96.28% (425 387 万)为高质量reads，在质控后与参考基因组序列进行比对，平均94.84%的clean reads 被定位到毛竹的基因组上。一个基因的FPKM (每千碱基百万个片段)≥1，则认为该基因在该样本中表达。在检测到的44 970 个基因中，31 516 个基因至少在一个样本中检测到表达，且随着笋高度的增加，表达基因数量呈现先上升后下降的趋势。

共鉴定出25 655 个基因至少在一个组合中的表达有显著差异。各个组合的DEG 的数量从113(S-8-MVSS-8-L，52 个上调和61 个下调) 至17 584 (S-2-MVSS-4-M，6 641 个上调和10 943个下调) 不等。不同高度笋第13 节节间的同一部位相比，DEG 的数量呈先增加后减少的趋势，且峰值在S-2VSS-4，不同高度笋上部的DEG 数量的差异比其他部位小。此外，上、下2 部分之间的DEG 均高于其他组合，同一节间不同部位的DEG 差异随着笋高度的增加而逐渐缩小。与前一高度笋相比，各组合共检测到13 924 个DEG；通过比较同一节间的不同部分，各组合共发现17 487个DEG。综上，共鉴定了11 504 个DEG，表明在笋的快速生长过程中转录水平存在活跃的动态变化机制。

2.3 DEG 的功能富集分析

在11 504 个DEG 中，8 381 个具有GO 注释，共注释获得5 610 个GO terms，其中生物学过程、分子功能和细胞成分分别具有3 389、1 582 和639个GO terms。具有高基因数量的生物学过程是细胞过程(Cellular process，GO ∶0009987)、代谢过程(Metabolic process，GO ∶0008152)、单一生物过程 (Single-organism process，GO ∶ 0044699)、生物调控(Biological regulation，GO ∶0065007)、生物过程调控 (Regulation of biological process，GO ∶ 0050789)。在分子功能类别中，结合(Binding，GO ∶0005488)、催化活性 (Catalytic activity，GO ∶0003824)、转运活性 (Transporter activity，GO ∶ 0005215)、结构分子活性(Structural molecule activity，GO ∶0005198) 最具代表性。在细胞成分范畴内，大量的基因被分配到细胞(Cell，GO ∶0005623)、细胞部位(Cell part，GO ∶0044464)、细胞器(Organelle，GO ∶0043226)、细胞膜(Membrane，GO ∶0016020)。对DEG 进行KEGG 通路富集分析，发现它们共富集到123 个通路中。除核糖体途径 (ko03010)外，苯丙氨酸生物合成途径(ko00940) 是最富集途径之一，其中大部分基因参与了木质素的生物合成。此外，许多DEG 被富集到次生代谢产物的合成(ko01110) 和代谢途径(ko01100)，其中大部分基因参与了生长发育所必需的次生代谢产物的合成。与碳水化合物和纤维素生物合成相关的DEG 显著富集到类黄酮生物合成(ko00941)和淀粉以及蔗糖代谢(ko00500)。

2.4 DEG 在木质化过程中的表达模式

通过聚类分析，11 504 个DEG 被分为4 个主要的Cluster。随着笋高度的增加，Cluster I 中DEG 呈下调趋势，它们参与细胞组织、细胞分裂、有丝分裂的细胞周期等细胞周期过程以及细胞发育等生物学过程，其中包括着丝粒蛋白E、DNA 结合蛋白和细胞分裂控制蛋白45 等。Cluster II 中DEG 的表达呈增加趋势，它们与SCW 的沉积和形成、次生代谢物的生物合成、各种运输途径和信号途径相关，包括木质素生物合成、氮化合物的运输、氨基酸的跨膜运输等，如PAL 基因和LAC 基因。Cluster III 中的DEG 呈现先增加后减少的表达趋势，它们参与细胞壁组织或生物合成，细胞壁大分子生物合成过程，该Cluster 中的大量DEG 与木质部生物合成、分解代谢和代谢过程以及半纤维素和纤维素代谢过程相关。Cluster IV 中的DEG 的表达模式复杂多样。此外，KEGG与GO 富集分析结果一致，苯丙氨酸生物合成是Cluster II 中显著富集的KEGG 途径之一。

2.5 参与木质素生物合成调节的转录因子

研究中发现，59 个家族的3 823 个转录因子基因至少在一个组合中差异表达，MYB (483)、MYB-related (377)、AP2-EREBP (303)、NAC(275) 等家族成员数目最多。筛除低丰度转录因子基因后，在毛竹中发现了30 个转录因子与拟南芥木质素合成调控的同源。几乎所有的转录因子基因都有相似的上调趋势(先增加后减少)，只有少数随笋高度的增加而持续增加。4 个NST/SND 转录因子被鉴定为主要调节因子，它们在较高的笋中高表达，而作为次级调控因子的MYB4s与NST/SND表现出相似的表达趋势。4 个MYB4在木质素调控网络的第2 层，其表达从嫩笋到老笋逐渐增加，在1.0 和2.0 m 笋中表达量较低；但在同一节间内却由上至下逐渐增加。

2.6 参与木质素生物合成的酶基因

研究中共鉴定了毛竹木质素生物合成相关12个家族280 个酶基因，其中153 个为DEG，其中48 个基因与拟南芥中已鉴定的基因同源。表达模式分析结果表明，几乎所有基因在S-1 样品中的表达量极低，尤其是参与木质素生物合成最后阶段的LAC和PRX，几乎没有检测到表达，之后这些基因被激活，特别是在4.0 m 笋中，其表达量急剧增加。在8.0 m 笋中，43 个DEG 的表达在所有部位都大幅下降。另外发现，在毛竹木质素生物合成途径中，上游基因的表达比下游基因的表达更早、更强。

2.7 miRNA 测序数据整体分析

为了鉴定毛竹快速生长过程中与木质化相关的miRNAs，构建了13 个miRNA 文库并进行了测序，在过滤低质量reads 之后，总共获得了58 871万个clean reads。，21 nt (46.94%) 的miRNA 是最丰富的一类，其次是24 nt (20.51%)、22 nt(15.85%) 和23 nt (9.92%) 的miRNA。总共获得了1 502 个miRNAs，其中已知的1 223 个，新的279 个，被聚类为237 个家族，且每个家族的成员存在明显差异。237 个家族中只有25 个家族的成员超过10 个，其中最多的是Ped-MiR166家族，有59 个成员，其次是Ped-miR159(58 个)和Ped-miR369(46 个)。160 个家族只有1 或2 个成员，如Ped-miR161、Ped-miR173、Ped-miR1023和Ped-miR1024。

2.8 木质化过程中差异表达的miRNAs(DEM)

结果表明，大多数已鉴定的miRNA 在多个样本中均有表达，在所有样本中共发现687 个DEM，其中441 个是已知的、246 个是新发现的，这些DEM 的表达趋势与DEG 具有相似的趋势。根据DEM 的TPM (transcript per million)，将相同高度的DEM 合并进行聚类分析，表达模式被聚为4 大类。随着笋高度的增加，Cluster I 的DEM 呈下降趋势，Cluster II 的DEM 呈上升趋势，而Cluster III 的DEM 呈现先增加后减少的趋势，与DEGs 相似，表达谱复杂的DEM 聚集在Cluster IV中。此外，有些DEM 的表达趋势与DEG 完全相反，这表明它们之间可能存在潜在的负调控靶向关系。

2.9 通过生信分析和降解组分析预测的miRNA 靶基因

根据已鉴定的miRNA 和毛竹已注释mRNA 序列，使用TargetFinder软件识别到1 430 个miRNAs 靶向于25 350 个基因，存在30 378 个miRNA-mRNA 对，包括610 个miRNAs 和7 940 个基因。此外，从降解组测序共识别了262 个已知的miRNAs 靶向135个基因，构成1 216 个miRNA-mRNA 对。通过生信预测和降解组分析，共鉴定出718 个(532 个为已知的、186 个为新发现的) DEM 靶向7 972 个基因。miRNA 与其靶基因共同参与多种生物过程，如氮化合物代谢过程的调控和有机循环化合物代谢过程的调控。生信预测和降解组测序均检测到的miRNA 共有103个，这为研究毛竹笋快速生长过程中miRNA 对靶基因的表达调控提供可靠信息。

2.10 木质素生物合成相关基因的共表达调控网络

在30 378 对miRNA-mRNA 对中，有16 467对(由5 756 个基因和691 个miRNA 组成) 耦合。通过降解组测序验证了一些miRNA-mRNA对，如PH02Gene04996和PH02Gene45333，它们被Ped-miR397a.1识别和切割。加权基因共表达网络分析(WGCNA) 结果表明:DEG 聚集到14个主要分枝，每个分支代表1 个模块。进一步分析表明green、bisque4、maroon、darkgrey 和coral1等5 个模块与木质化程度呈高度正相关，表明这些模块中的基因可能在笋木质素生物合成中起重要作用。

结合木质素生物合成途径、WGCNA 和相关的miRNA-mRNA 对的分析，构建了一个包含11个miRNA、22 个转录因子和36 个酶基因的木质化调控网络。进一步分析表明，在4 个MYB103和36 个关键酶基因的启动子中发现了SCW NAC结合元件(SNBE)、AC 元件和SCW MYB 反应元件(SMRE)。3 个NST/SND 转录因子通过调控PeMYB103的表达来参与该调控网络，而下游的17 个转录因子直接调控来自36 个酶基因。此外，相关性分析可知所有22 个转录因子至少与1 个木质素生物合成途径中的关键酶基因具有极强的相关性。

2.11 木质化调控网络中遗传因子的验证

为了验证该木质化调控网络，采用RT-qPCR检测了网络中11 对miRNA-mRNA 的表达水平，发现miRNA 与相对应的mRNA 呈相反的表达趋势，这与高通量测序的结果相似。部分miRNAmRNA 对，如Ped-miR397b.1/Ped-miR397b.3-PeLAC35(PH02Gene45333) 和Ped-miR397b.1/Ped-miR397b.3-PeLAC10(PH02Gene04996) 通过降解组测序得到了证明。此外，大多数miRNAmRNA 对在快速生长后期(6.0 和8.0 m) 相耦合，这与降解组测序结果一致。一些关键转录因子的RT-qPCR 结果表明，它们的表达模式与其靶向木质素生物合成相关酶基因相似，而酶基因启动子序列中调控元件的分析和酵母单杂交实验结果验证了酶基因受到转录因子的调控。

在毛竹基因组中共鉴定出43 个LAC 基因(PeLAC1～ PeLAC43)。PeLAC20 与AtLAC4 有较高的氨基酸序列相似性，AtLAC4参与到拟南芥茎的木质化过程，本研究利用在拟南芥中过表达PeLAC20的来研究其功能。获得了4 个PeLAC20的转基因拟南芥株系，对2 个转基因株系(L1 和L3) 进行了木质素的分析，结果表明L1 和L3 的茎部维管束比Col-0 染色更深，木质素含量更高，表明过表达PeLAC20可以促进拟南芥的木质化。此外，过表达PeLAC20的酵母细胞在含有ABTS的底物上呈现深绿色，证明该蛋白是铜离子结合蛋白，其酶活性最高为2.031 U/mL。

为了证实PeMYB4.1 和PeMYB20/85.2 与PeLAC20启动子的相互作用，进行酵母单杂和凝胶迁移实验(EMSA)。酵母单杂证实PeMYB4.1和PeMYB20/85.2 能够与PeLAC20启动子结合。EMSA 结果表明，随着未生物素标记的探针(冷探针) 的增加，生物素探针与蛋白的结合效率逐渐降低。因此，提出了一个可靠的miRNA 介导的‘MYB-PeLAC20’ 的木质素单体聚合模型。

3 讨论

竹秆是竹子的主要利用部位，其形态建成经历了地下笋生长、地上笋(未成熟茎) 快速生长和竹秆纤维细胞壁连续木质化3 个重要时期，竹笋的快速生长伴随着纤维束的木质化。竹纤维具有强度高、韧性好、刚性大、性能稳定等特点，体现了竹秆优良的物理力学性能。一般认为，竹的木质化过程是竹初生细胞壁形成后木质素动态沉积的过程。竹子的快速生长主要是通过每一个节间来实现的，其中木质化程度对竹子性能发挥着重要作用。因此，系统研究快速生长过程中具有代表性的笋单个节间的木质化现象，将有助于阐明整个毛竹木质化的调控机制。

3.1 竹笋木质化过程中的动态变化

基于形态学、生理学和组学的分析，将竹笋快速生长期的木质化过程分为3 个阶段，并且在单个节间不同部位在3 阶段存在一个特殊的木质化程度的转变过程。在第I 阶段是从笋1.0 m 到2.0 m，期间笋的木质化进程非常缓慢，因为此时大部分细胞处于分裂伸长阶段，同样参与木质素合成的酶活性均处于较低水平。第II 阶段是从笋2.0 m 到6.0 m，该过程笋的木质化速度较快，此时细胞分裂和伸长趋于结束，随之木质素合成的酶活性提高，木质素加速合成和沉积，细胞以细胞壁的增厚为主要生物学过程。在第III 阶段，笋进一步木质化，但是其速度明显减慢，笋逐步生长成为木质素含量较高的新竹，在这个阶段笋细胞的伸长已完成且木质素生物合成相关的酶活性依然保持在高水平。

笋的木质化速率在快速增长期间经历了一个先上升后下降的过程，同时组织化学分析和木质素含量也发现了类似的趋势。虽然在细胞伸长完成和木质化开始这3 个阶段之间没有明确的界限，但我们认为它们是同时发生的。此外，同一节间的3 个部分在时间和空间上经历了类似的生物过程但并不同步，这就导致不同程度的木质化同时出现在同一个节间。在第I 阶段和第II 阶段，木质化程度从上至下依次降低，这与同一节间中细胞伸长从上至下依次发生并完成的结果相一致。然而，在8.0 m 笋节间不同部位的木质化程度发生了一个相反的变化，变为下部>中部>上部，该结果与木质素含量以及组织化学染色的结果相一致。这可能与笋箨的衰老和脱落有关，箨起初承担着竹笋的保护者和碳水化合物供给者的角色，然后随着节间木质化程度的增加，尤其是单个节间下部，这使得节间有足够的力量支撑整个竹秆，此时箨完成其使命逐渐老化直至最后脱落。但是，木质化与箨衰老之间的关系尚无实验证明，需要进一步的研究来验证。

3.2 木质素生物合成酶基因的时空表达变化

生物过程的动态变化依赖于基因的时空表达。本研究中与细胞分裂相关的基因的表达随着笋的生长持续下降，但与木质素生物合成相关的基因的表达量从第I 阶段到第III 阶段呈现上调趋势，这与先前孝顺竹的单节间的研究结果一致。木质化依赖于木质素的生物合成，涉及多种代谢途径，其中最重要的是苯丙烷代谢途径 (ko00360 和ko00940)，该结果与我们的GO 和KEGG 通路分析一致。本研究中，毛竹中共鉴定出280 个参与木质素生物合成的基因，超过拟南芥(112)、毛白杨(193) 和水稻(126)，表明部分基因家族可能会发生基因加倍事件，而这些基因加倍可能是其木质化速度快和机械性能优良的原因。

此外，本研究中发现，木质素生物合成途径中的48 个DEG 表达量较高，它们的表达模式与笋的木质化的动态变化趋势基本一致，表明它们是毛竹木质素生物合成的主要候选基因。PAL 催化L-苯丙氨酸脱氨转化为反式肉桂酸，并使碳通量从初级代谢转化为苯丙氨酸代谢。PePAL在笋木质化过程中表达量上调，这与杨树的研究结果一致。5 个PePAL在笋发育的早期阶段在转录水平表达高于其他DEGs，原因可能是它们的激活为下游木质素生物合成提供大量的肉桂酸进入苯丙氨酸通路。酶基因的动态表达具有高度的时空特异性，酶活性随之发生动态变化，导致竹笋单个节间木质化的时空差异。

3.3 竹子木质化调控过程中转录因子与miRNAs 的普遍性与特殊性

目前，拟南芥的次生细胞壁合成调控网络已较为完善，该网络是由不同的miRNAs 和转录因子组成，它们可以激活或抑制12 个家族的木质素生物合成相关酶基因转录和转录后水平，导致木质化的动态变化。NST/SND 转录因子是通过调控MYB 转录因子基因从而启动木质素生物合成的主控开关。本研究中6 个NACs 和13 个MYB 与酶基因发生互作，大多数上游调控因子与其推测的靶基因的表达呈现很强相关性。下游转录因子和酶基因与上游转录因子的表达模式相似，RT-qPCR和酵母单杂实验间接验证了这一点。此外，降解组测序和RT-qPCR 对miRNAs 靶向的酶基因的验证也支持了它们之间的调控关系。

本研究鉴定了9 个与竹笋木质化相关的MYB，直接正向调控酶基因的时空表达。同时，还有4 个PeMYB4作为负向调控因子在竹笋中高表达，它们与反馈调节有关，这与之前拟南芥中的研究一致。AtMYB26 作为NAC 的上游调控因子，在调控次生细胞壁的形成中起着至关重要的作用。AtMYB26 和AtVND6/7 与毛竹中同源基因间的序列相似性很低(<40%)，且编码这些蛋白的基因在笋中的表达水平极低，原因可能是这些基因主要不是在笋中表达，水稻和拟南芥的相关研究结果也支持这样的假设，即AtMYB26和AtVND6/7在花药和其他花组织中特异表达。由此表明，NAC 和MYB 在毛竹笋中的调控关系尚不明确。

多种miRNA 通过调控转录因子和木质素生物合成基因，在木质化过程的转录后水平发挥多种重要作用。本研究中也证明PeLAC35是PedmiR397a.1 的靶向基因，该结果表明miR397 在不同物种间的木质素生物合成的调控网络中功能是保守的。miR164 通过抑制转录因子的表达在木质化形成中发挥关键作用，本研究中同样PedmiR164a.1 被鉴定为木质化过程中调控LAC的抑制因子。然而，在本研究中没有检测到与miR397和miR164 等保守miRNA 特异靶向的转录因子。相反，在PeNST/SND1.2和PeMYB20/85.2中被鉴定为Ped-miR528-3p 和Ped-miR399j-5p 的靶基因，在PeSND2/3.1和PeSND2/3.4中发现了unkown_ Ped-miR_ 44的切割靶点，这为竹子木质化过程中遗传调控研究提供了新的思路。

3.4 竹子木质化调控模型

本研究通过整合mRNA 和miRNA 的联合分析，结合降解组测序，确定了竹笋木质化过程中的关键调节因子，为其他单子叶植物木质素调控的研究提供了参考。在综合分析的基础上，成功地建立了一个复杂的竹笋木质化调控网络，包括11 个miRNA、22 个转录因子和36 个关键酶基因，提出了miRNA 介导的‘MYB-PeLAC20’ 的木质素单体聚合的调控模型。研究结果为全面理解毛竹木质素生物合成途径中miRNA、转录因子和酶基因的协同调控网络具有重要参考价值，有助于通过基因工程来实现提高竹子的产量和品质。

原文出处

Yang K B，Li L，Lou Y F，Zhu C L，Li X，Gao Z M.A regulatory network driving shoot lignification in rapidly growing bamboo.Plant Physiology，Published:19 June 2021.DOI:https://doi.org/10.1093/plphys/kiab289.