黑曲霉YF1 菌株固体菌剂对烟嘧磺隆降解效果研究

王佳颖，郑 宇，王振梅,2，杨冬臣，张 哲,3，张金林

（1.河北农业大学 植物保护学院，河北 保定 071001；2.河北兴柏农业科技有限公司，河北 石家庄050000；3.西湖大学 工学院，浙江 杭州 310024）

烟嘧磺隆（Nicosulfuron）是玉米田常用的内吸传导型除草剂［1-2］，其通过抑制植物体内乙酰乳酸合成酶的活性来阻止支链氨基酸合成，进而阻止细胞分裂使敏感植物停止生长最终导致死亡［3-4］。近年来，烟嘧磺隆及其复配制剂的大量使用导致残留药害问题增多，特别是敏感作物如小麦和十字花科蔬菜等更容易产生药害［5］。

微生物降解是农药降解过程中极为重要的途径［6-7］，已经成为修复土壤中烟嘧磺隆残留的重要手段［8］。赵浩宇等［9］分离出1 株硝基假单胞菌NSA02，将其接种到烟嘧磺隆处理过的土壤样品中，烟嘧磺隆的降解率比未接种NSA02 的土壤高5 ～6倍。朱将伟等［10］从土壤中分离得到1 株短小芽孢杆菌ZHU-11，在96 h 内对土壤中浓度为20 mg/kg的烟嘧磺隆降解率达97%，并在此基础上研发了菌剂，该菌剂可以降低土壤中烟嘧磺隆的残留。张哲等［11-12］将可降解烟嘧磺隆的枯草芽孢杆菌YB1 加工成颗粒剂，当土壤中添加20 g/kg YB1 菌株颗粒剂，28 d 后可将土壤中浓度为1 mg/kg 的烟嘧磺隆降解至对小麦无明显药害水平。微生物固体菌剂还被应用于水体净化和诱导植物产生抗病能力等方面［13-14］。

黑曲霉是一种丝状真菌，被广泛应用于生产有机酸［15］、加工酶制剂［16］和进行污水处理［17］等方面。本实验室前期利用富集培养技术从农药厂污泥中分离得到1 株可降解烟嘧磺隆的黑曲霉YF1［11］，并对其在液体环境对烟嘧磺隆的降解条件进行了优化［18］。在此基础上，本研究将YF1 加工为固体菌剂，并通过田间试验验证其在土壤中的实际降解效果，以期为解决环境中烟嘧磺隆残留问题提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种与植物 黑曲霉（Aspergillus niger） YF1 菌株，由河北农业大学植物保护学院农药实验室保存。小麦（Triticum aestivumL.），品种为‘石新828’；白菜（Brassica pekinensisR.），品种为‘青麻叶’，供试种子均购于保定市农资市场。

1.1.2 供试试剂及材料 烟嘧磺隆原药（纯度≥97.5%，山东京博农化有限公司）；10%烟嘧磺隆油悬浮剂（广东省佛山市盈辉作物科学有限公司）。固体发酵料：将麦麸与秸秆经粉碎后过80 目筛，然后按质量比3∶7 的比例进行配置。供试土壤：河北农业大学三园实践地未使用过烟嘧磺隆的土壤，自然风干过筛备用（孔径3 mm）。

1.2 方法

1.2.1 YF1 菌株固体发酵条件优化 ①固体发酵初始pH 对活菌数的影响。分别调节固体发酵料的pH值为6、6.5、7.0、7.5 和8.0，添加蛋白胨的量为5%，接种量为13%（使YF1 菌株固体培养基中初始孢子量为3.7×105cfu/g），含水量为150%，在培养箱中35 ℃培养7 d，试验重复3 次。采用血球计数板统计各个处理下YF1 菌株的产孢数，计算初始pH对YF1 菌株产孢量的影响，确定发酵最佳pH 值。

②固体发酵时间对活菌数的影响。根据上述结果，选择初始pH 值为7.5 的培养基，按照上述方法进行接种，分别置于35 ℃培养箱中静置培养72、96、120、144 和168 h，试验重复3 次，用血球计数板统计各个处理的产孢数，计算不同培养时间对YF1 菌株产孢量的影响，确定最佳固体发酵时间。

1.2.2 YF1 菌剂的加工及生物特性检测 根据1.2.1试验结果，采用最优发酵条件进行YF1 固体菌剂制备。在YF1 固体发酵料中添加1%保护剂羧甲基纤维素钠挤压造粒，并参考农用微生物菌剂标准对菌剂中有效活菌数、杂菌数、水分、pH 进行测定。

1.2.3 YF1 菌剂室内降解效果测定 ①小麦对烟嘧磺隆的敏感性测定。经拌土处理，土壤中烟嘧磺隆的含量分别为0、0.012 5、0.025、0.05、0.1 和0.2 mg/kg。 小麦种子催芽后挑选长势相近的进行播种，每盆10粒，每个浓度重复3 次，置于人工气候室培养，温度（25±2）℃，湿度（69±2）%，14 d 后测量每个处理中小麦植株的根长、株高、鲜重和干重。采用SPSS 21.0 软件进行数据处理，计算抑制率。

②不同菌剂添加量对不同浓度烟嘧磺隆降解效果的影响。设置土壤中烟嘧磺隆浓度为0.025 mg/kg， YF1 菌 剂 添 加 量 分 别 为0、3.125、6.25、12.5 和25 g/kg；设 置 烟 嘧 磺 隆 浓 度 为0.05 mg/kg，菌 剂添加量为6.25 和12.5 g/kg；设置烟嘧磺隆浓度为 0.1 mg/kg，菌剂添加量为12.5 和25 g/kg。添加菌剂后所有处理置于人工气候室中，分别在14、21、28、35 和42 d 时取土样播种小麦，方法同上，试验重复3 次。14 d 后测量株高和鲜重，计算抑制率。

1.2.4 YF1 菌剂的田间降解效果测定 在河北农业大学三园实践地进行小区试验，实践地未施用过烟嘧磺隆除草剂。以小麦和白菜为供试植物，小区面积设置为0.36 m2，8 个处理：空白土壤小区，作为CK；喷施10%烟嘧磺隆油悬浮剂小区，终浓度分别为30、40 和50 mL/667 m2，记为CK+N1、CK+N2和CK+N3；空白土壤小区和喷施烟嘧磺隆小区同时撒施YF1 菌剂，菌剂施用量20 kg/667 m2， 记为CK+YF1、CK+N1+YF1、CK+N2+YF1和CK+N3+YF1， 每个小区重复3 次。30 d 后播种小麦和白菜，出苗后14 d 测量根长、株高和鲜重，并计算抑制率。

2 结果与分析

2.1 YF1 菌株固体发酵条件优化

2.1.1 固体发酵初始pH 对活菌数的影响 由图1可知，YF1 的孢子数量随着初始pH 的增加先增加后减少，当pH 值为7.5 时，孢子数量达到最大值为5.9×109cfu/g，显著高于其他处理（P＜0.05），因此YF1 菌株固体发酵的最适初始pH 值为7.5。

图1 培养基初始pH 对YF1 菌株产孢量的影响Fig.1 The effect of initial pH on the spore production of YF1 strain

2.1.2 发酵时间对活菌数的影响 由图2 可知，YF1 的孢子数量随着发酵时间的增加先增加后减少，当培养时间为144 h 时，孢子数量达到最大值为6.3×109cfu/g，显著高于其他处理（P＜0.05），因此YF1 菌株固体菌剂发酵的最佳时间为144 h。

图2 不同培养时间对YF1 菌株产孢量的影响Fig.2 The effect of different cultivation time on the spore production of YF1 strain

2.2 YF1 菌株菌剂加工及生物特性检测

依据GB-20287-2006 农用微生物菌剂的测定方法，测定YF1 菌剂中的有效活菌数及杂菌数，结果如表1 所示，符合农用微生物菌剂的标准。

表1 YF1 菌株菌剂生物特性检测Table 1 The biological characteristics of YF1 strain granules

2.3 YF1 菌剂室内降解效果

2.3.1 小麦对烟嘧磺隆敏感性的测定 由试验结果可知，烟嘧磺隆对小麦株高的IC25、IC50和IC75分别为0.025、0.05 和0.1 mg/kg 干土。 小麦株高和土壤中烟嘧磺隆浓度之间成线性关系，方程为Y= 2.784X+ 3.590，相关系数R² = 0.979。小麦鲜重与土壤中烟嘧磺隆浓度之间成线性关系，方程为Y= 2.422X+ 2.024，相关系数R² = 0.944。故选择以小麦的株高和鲜重为后续室内试验的主要测量指标。

2.3.2 不同菌剂添加量对不同浓度烟嘧磺隆降解效果的影响 不同量YF1 菌剂对不同浓度烟嘧磺隆在小麦上产生的药害均有一定缓解作用，不同浓度下主要有代表性的结果如图3 所示，施用YF1 菌剂14、21、28、35 和42 d 后，随着菌剂添加量的增加，各处理对小麦株高和鲜重的抑制率均显著低于不添加菌剂组（P＜0.05）。当土壤中烟嘧磺隆浓度为0.025 mg/kg，添加菌剂 12.5 g/kg 处理35 d 后能将烟嘧磺隆对小麦株高和鲜重的抑制率分别由33.95%和17.51%降低至0.79%和-4.7%；当烟嘧磺隆浓度 为0.05 mg/kg 时，添 加 菌 剂12.5 g/kg 处 理35 d后能将烟嘧磺隆对小麦株高和鲜重的抑制率分别由45.23%和34.17%降低至1.55%和-13.87%；当烟嘧磺隆浓度为0.1 mg/kg 时，添加菌剂25 g/kg 处理42 d 后能将烟嘧磺隆对小麦株高和鲜重的的抑制率由50.77%和41.16%降低至-8.47%和-10.55%。

图3 室内盆栽试验数据统计结果（抑制率 %）Fig. 3 The statistical results of indoor experiment data（inhibition rate/ %）

2.4 YF1 菌剂田间降解效果

由表2 可知，CK+YF1 处理对2 种作物的各项生理指标的抑制率均为负值，即添加菌剂后对作物安全。CK+N1+YF1、CK+N2+YF1 和CK+N3+YF1处理对小麦的株高和鲜重及白菜株高的抑制率均显著低于CK+N1、CK+N2和CK+N3处理（P＜0.05）；CK+N1+YF1 处理对小麦和白菜的根长的抑制率均显著低于CK+N1处理。其中CK+N2+YF1 处理对白菜株高的缓解效果最明显，可将烟嘧磺隆对白菜株高的抑制率由64.34%降低至27.66%。CK+N3+YF1处理对小麦株高的缓解效果最明显，可将烟嘧磺隆对小麦株高的抑制率由38.39%降低至-5.45%。说明YF1 菌剂可以较好的缓解烟嘧磺隆对小麦和白菜各项生理指标造成的抑制作用。

表2 田间小区试验数据统计结果（抑制率 %）Table 2 The statistical results of field experiment data（inhibition rate %）

3 讨论与结论

不同菌株由于其生理特征不同，因此其最适培养条件也会出现差异。本实验中得出的YF1 固体菌剂的最佳发酵条件：初始pH 为7.5，培养时间为144 h。马永强等［19］对具有除草活性的生防菌株GD-9 进行固体发酵条件的优化，筛选出最适初始pH 为7.6，最适培养时间为147.8 h。郑露华等［20］对尖孢镰刀菌LD105 进行固体发酵条件优化，筛选出最适初始pH 为6，最适培养时间为120 h。马晓亮［21］对烟嘧磺隆降解菌粘质沙雷氏菌N80 进行固体发酵条件优化，筛选出最适培养时间为24 h。目前尚未见到文献报道烟嘧磺隆降解菌固体发酵条件中对初始pH 的优化，因此，本试验研究结果可为其他降解菌固体发酵条件的优化提供一定的参考。

本试验室内盆栽试验结果表明，YF1 菌剂可缓解小麦所受烟嘧磺隆的药害，随着土壤中烟嘧磺隆浓度的增加，YF1 菌株菌剂的用量及降解时间也随之增加，当烟嘧磺隆的浓度为0.1 mg/kg 时，添加菌剂25 g/kg，降解时间需42 d 才能将烟嘧磺隆对小麦株高的药害完全缓解。田间小区试验结果表明，YF1 菌剂均可减轻小麦和白菜所受不同浓度烟嘧磺隆的药害，其中对小麦药害缓解的效果更明显，当施药量为40 和50 mL/667 m2时，添加菌剂后均可使烟嘧磺隆对小麦株高的药害完全缓解。谭佳丽［22］研究表明，将肠杆菌TYM-1 接种到烟嘧磺隆浓度为1 mg/kg 的土壤中进行室内盆栽试验，28 d 后烟嘧磺隆的降解率为84%。马晓亮等［23］研究表明，添加粘质沙雷氏菌N80 可以促进土壤中浓度为10 mg/kg 烟嘧磺隆的降解，30 d 后降解率为79.7%，用甜菜、小白菜和菠菜作为指示植物进行室内盆栽试验，添加降解菌N80 的处理提高了指示植物的出苗率。上述试验结果都是在室内进行的，田间实际应用的效果还有待进一步验证，所以具有一定的局限性。本研究将YF1 菌剂添加到烟嘧磺隆浓度为0.05 mg/kg的土壤中，28 d 后播种小麦进行室内盆栽试验，可将烟嘧磺隆对小麦株高的药害降低至无明显药害水平，在此基础上进行了田间小区试验，并且具有较好的降解效果，田间试验设计的10%烟嘧磺隆油悬浮剂的浓度范围为30 ～50 mL/667 m2，符合生产中的实际用量。

本研究将可降解烟嘧磺隆的黑曲霉YF1 加工为固体菌剂，通过敏感植物生长指示的方法来反应施用菌剂后对烟嘧磺隆的降解效果，结果显示YF1 菌剂在室内和田间小区均可以缓解烟嘧磺隆对敏感植物的药害，表明YFI 菌剂对土壤中烟嘧磺隆有较好的降解作用。前期研究报道的均为细菌菌剂应用于土壤中烟嘧磺隆的降解［9-12,21-23］，而YF1 是真菌菌剂，本研究丰富了烟嘧磺隆降解菌剂的资源，在缓解烟嘧磺隆药害方面具有重要研究意义。