利用重组自交系定位水稻种子低氧发芽力QTL

张所兵，张云辉，陈海元，林 静，汪迎节，朱晓妹，宋春凤，方先文

(1.江苏省农业科学院 种质资源与生物技术研究所，江苏省农业种质资源保护与利用平台，江苏 南京 210014；2.江苏省中国科学院 植物研究所(南京中山植物园)，江苏 南京 210014)

水稻栽培方式主要有移栽和直播2种栽培模式。移栽稻是将水稻种子先育苗，再栽插到大田中的一种栽培方式。直播稻是指将水稻种子直接播入大田中的一种栽培方式。较之移栽稻，直播稻省去了育秧和移栽2个环节，极大节约了种植成本，提高了经济效益。目前，许多国家水稻栽培模式主要以直播为主，如美国、澳大利亚、意大利、日本、斯里兰卡和马来西亚等[1-3]。随着农村青壮年劳动力向非农业领域转移，我国直播稻面积也呈现逐年增加的趋势。直播稻的栽培面积在2007年以前的仅为2%，现在已增加至30%以上[4]。

制约直播稻发展的主要因素之一是直播时低温、低氧的环境因素导致的出苗不齐、缺苗等现象[1, 5-10]。解决该问题的有效措施是提高水稻种子耐低温和低氧发芽能力。已有研究证实，水稻低氧发芽力在不同的水稻品种间存在明显差异，且低氧发芽力是多基因控制的复杂的数量性状[11-13]。侯名语等[11]利用Kinmaze/DV85 重组自交系群体分析了控制水稻低氧发芽力的QTL, 共检测到5 个低氧发芽力QTL，分别位于第1，2，5，7 号染色体上，贡献率10.5%～19.6%。Jiang等[14]利用USSR5/N22 F2群体定位了2个低氧发芽力QTLs，分别定位于第5，11号染色体，分别可以解释15.51%和10.99%表型变异。陈孙禄等[12]利用R0380/RP2334回交自交系群体定位了4个低氧发芽力QTLs，分别定位于第2，3，8号染色体，贡献率最小的为9.37%，贡献率最大为17.34%。孙凯等[15]利用200 份水稻种质为材料对低氧条件下，芽鞘长度进行GWAS分析，共检测到15 个与芽鞘长显著关联的位点，分布在第3，4，5，6，8，11 染色体上。Yang等[16]利用YZX/02428重组自交系群体定位了25个低氧发芽力的QTL，分别位于除第11号染色体外的其他11条染色体上。

虽然人们在水稻低氧发芽资源筛选及相关的QTL定位和基因克隆等方面取得了一定进展，但总的来说，控制低氧发芽遗传位点的挖掘仍然比较有限。筛选新的耐淹水种质资源，定位更多控制低氧发芽的QTL，并对相关基因进行克隆，对水稻低氧萌发育种和阐明耐低氧发芽分子机理有重要意义。本研究以云南省籼稻地方品种扎西玛和江苏省优良食味粳稻品种南粳46 构建的RIL群体，对控制低氧发芽性状进行QTL定位，为下一步基因克隆和育种利用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

以云南省籼稻地方品种扎西玛(母本)与江苏省优良食味粳稻品种南粳46(父本)为亲本，用单粒传法构建了含有135个家系的RIL群体[15-17]。

2019年正季，亲本材料及其包含135个家系的RIL群体种植于江苏省农业科学院南京试验田。株距和行距分别为13.3，30.0 cm。田间管理与一般大田相同。

1.2 低氧发芽检测

为了打破休眠，将亲本及各家系的种子置于50 ℃烘箱中放置7 d。低氧发芽试验参照陈孙禄等[12]和Jiang等[14]进行，具体如下：从亲本及135个家系中，随机选取健康饱满一致的种子，用84消毒液(原液)消毒30 min，然后用无菌去离子水清洗5次后，置于装满无菌去离子水的10 cm高的离心管中，并密封。每份材料4管，每管5粒, 3次重复。于人工气候室中28 ℃，黑暗培养。7 d后调查胚芽鞘长度，作为低氧发芽力的指标[12,16]。

1.3 QTL分析

用QTL IciMapping 4.0[18]检测低氧发芽力QTL，LOD阈值设为2.5。QTL 命名按McCouch等[19]的方法进行。

SSR标记RM1300和RM1227选自Gramene(https://archive.gramene.org/)。RM1300引物序列为：RM1300-F:CAGCCATGAATGTTGGCTAC和RM1300-R:GCCATGTCCATTTATGGTGC，RM1227引物序列为：RM1227-F:CATGGTAGCACACACCCTTG和RM1227-R:CATCGACATGTGGACCACTC。

2 结果与分析

2.1 亲本及群体低氧发芽分析

在低氧条件下发芽7 d后，以胚芽鞘长度为标准，对扎西玛和南粳46低氧发芽力进行了调查，结果发现：扎西玛胚芽鞘长度为2.92 cm，而南粳46胚芽鞘长度为6.68 cm，二者差异在P=0.01水平上达到极显著水平(图1)。扎西玛/南粳46 RIL群体胚芽鞘长度呈现为连续的分布，胚芽鞘长度为1.32～5.99 cm，群体胚芽鞘长度次数呈正态的分布(图2)。

A.低氧条件下发芽7 d，扎西玛(左)和南粳46表型(右)；B.低氧条件下发芽7 d，扎西玛和南粳46胚芽鞘长度；A′和B′表示P=0.01水平差异显著。

图2 扎西玛/南粳46 RIL群体胚芽鞘长度次数分布

2.2 低氧发芽QTL分析

本研究前期构建了扎西玛/南粳46 RIL群体SSR标记分子连锁图谱，该图谱共包含202对SSR标记，总长度为1 437.3 cM，平均图距为8.1 cM，能满足QTL 作图的要求。根据群体中135个家系低氧发芽力数据，利用QTL Ici-Mapping 4.0对控制低氧发芽QTL进行检测，在第12号染色体上的RM1300和RM1227之间检测到一个控制低氧发芽力的QTL(qAG-12)，qAG-12位于第12染色体上26.00～27.34 Mb的1.34 Mb范围内。该QTL来自南粳46，LOD值为3.04，可以解释11.24%的表型变异(图3)。

图3 水稻低氧发芽力QTL检测

3 讨论与结论

耐淹成苗率低、杂草问题等是影响直播稻产量的重要因素。与传统的移栽稻相比，直播稻种子在萌发时处于淹水环境之中。淹水环境有利于控制田间杂草却不利于直播稻成苗，水直播稻成苗率通常在30%左右[20]。这主要归因于以往的育种过程中，很少对低氧萌发等与直播水稻相关的性状进行人为选择，这直接导致目前市场上正在推广的绝大多数水稻品种不适合进行田间直播[20-22]。开展耐淹水的种质资源筛选，挖掘在低氧条件下萌发能力强的水稻资源，并在水稻育种过程中加以利用和选择是提高耐淹成苗率的关键。此外，控制耐淹成苗率的遗传位点的挖掘仍然比较有限，且控制耐淹成苗率的遗传位点都是由多基因控制的复杂的数量性状，遗传力较低，常规的育种选择费时费力。因此，开展控制耐淹成苗率的遗传位点的定位研究，继而进行多基因分子标记辅助聚合育种，有望提高水稻种子低氧发芽能力，进而改善解决直播稻全苗问题。

本研究对云南地方品种扎西玛和江苏省优质稻品种南粳46低氧发芽进行了鉴定，发现二者差异极显著，进而利用扎西玛/南粳46 RIL群体在12染色体上定位到一个主效QTL，位于SSR标记RM1300和RM1227之间，为该QTL育种利用提供了材料和分子标记。将RM1300和RM1227在日本晴基因组中进行定位，发现其位于第12染色体上26.00～27.34 Mb。该候选区域未见报道的低氧发芽的QTL，故qAG-12是一个新的QTL。在Rice Genome Annotation Project(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)对该候选区间注释发现，在这1.34 Mb范围内共有200多个注释基因。接下来，拟从扎西玛/南粳46 RIL群体中选择含有qAG-12单株与扎西玛构建F2次级分离群体，对qAG-12进行精细定位，为下一步基因克隆奠定基础。

在淹水条件下，扎西玛和南粳46种子低氧发芽力呈现极显著差异，并利用扎西玛/南粳46 RIL群体在第12染色体上定位到一个新的控制水稻种子低氧发芽力的QTL(qAG-12)。