甘薯G病毒基因克隆及组培快繁苗病毒检测

2021-01-07蒋素华白冰洋牛苏燕邰作峰梁芳袁秀云崔波

江苏农业科学 2021年24期

蒋素华白冰洋牛苏燕邰作峰梁芳袁秀云崔波

摘要：为了脱除甘薯G病毒，获得优良的脱毒甘薯种苗，提高甘薯的质量和产量，根据NCBI上已报道的甘薯G病毒外壳蛋白基因序列设计引物，用RT-PCR克隆了商薯19叶片G病毒外壳蛋白基因序列。测序结果显示，获得的G病毒外壳蛋白基因为800 bp，与报道的基因序列同源性达99%。经过茎尖脱除病毒和组织快繁技术发现，商薯19芽诱导的最适培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA;苗增殖的最佳培养基为1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+2.0 g/L 椰汁水;根诱导的最适培养基为1/2MS+0.5 mg/L NAA。经过PCR检测，商薯19中确实存在G病毒，经过茎尖脱除病毒后，G病毒的脱毒率达到83%。这为获得甘薯脱毒苗及甘薯病毒检测提供了实践操作的依据。

关键词：甘薯;G病毒;基因克隆;病毒检测;组培快繁苗

中图分类号：S531.01;S531.043 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2021）24-0060-04

收稿日期：2021-04-23

基金项目：河南省高等学校重点科研项目（编号：21B210011、21A210029）;河南省科技攻关计划（编号：202102110167）;河南省科技特派员经费项目。

作者简介：蒋素华（1983—），女，河南漯河人，硕士，副教授，主要从事花卉分子生物学研究。E-mail：jiangsuhua2006@163.com。

通信作者：崔波，博士，教授，主要从事植物分子生物学研究。 E-mail：laocuibo@163.com。

甘薯种植作为我国覆盖范围较为广泛的农作物生产类型，在我国南北地区均有发展，病毒病在我国各个甘薯种植区快速大范围的蔓延，对甘薯质量和产量造成了巨大的损失[1-4]。在传统种植模式中，由于缺乏对种薯块根内病毒的有效处理技术，导致我国甘薯生产效益不同程度地降低，近几年甘薯脱毒技术虽不断改进和发展，但是真正能用于实际生产并且大面积使用的脱毒技术还未见报道。因缺乏可大范围推广的脱毒技术，故甘薯脱毒技术及脱毒甘薯种植仍处于初步发展阶段，还无法在全国推广。

甘薯G病毒（SPVG）属于马铃薯Y病毒属病毒，是单链的RNA病毒，对主要侵染的甘薯病毒SPFMV和SPCSV有很重要的协同作用[5-6]。马铃薯Y病毒属基本都有一个高度保守的区域，即DAG（Asp-Ala-Gly）三联体，它在病毒外壳蛋白（CP）的 N-末端[7]。甘薯G病毒序列保守性特点为采用RT-PCR的方法检测G病毒提供了方便。甘薯是通过营养体繁殖的，病毒极易传递给后代[8]。迄今为止，国内外尚未培育出高抗病毒的实用甘薯品种或者能抵抗病毒侵染的高效农药[9]。多年来，海内外的专家学者都致力于探讨高效的甘薯脱毒方法[10-13]。伴随着组织培养技术的发展，利用茎尖进行甘薯脱毒，为甘薯植株脱毒提供了一条新途径，成为无毒甘薯生产的首要方法[14-16]。但茎尖组培快繁技术要求高，难度较大，再生植株的分化受甘薯品种、培养基成分等因素的影响，导致成苗率不高，于是探究最高效的甘薯茎尖分生组织培养方法很有必要。本研究采用RT-PCR的方法从商薯19叶片中克隆出G病毒外壳蛋白基因，建立了一套甘薯G病毒检测体系，并利用组织培养快繁技术，探讨不同植物生长激素组合对商薯19茎尖的诱导、分化、增殖以及生根的影响，为推广商薯19脱毒苗和高效病毒检测方法提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 甘薯样品、菌株和载体

商薯19于2020年8月取自郑州师范学院新沟村试验田。菌株DH5α（大肠杆菌），克隆载体pMD19-T Vector，均购于TaKaRa公司。

1.2 试剂

dNTP、DNA marker均购自TIANGEN公司;反转录酶、RNA酶抑制剂、rTaq酶购自TaKaRa公司;其他为国产纯化试剂。

1. 3 引物的设计与合成

从NCBI下载G病毒基因的核苷酸序列，利用Primer 5.0生物软件以及DNAMAN软件设计1对引物：GCPF，GCAGGAAAAACAGGAAACAC;GCPR，TGTAGACCATACCTCGGCAT。

1.4 商薯19葉片总RNA提取及目的基因克隆

取0.1 g商薯19叶片，在液氮中迅速研磨成粉末，提取总RNA，鉴定完整性。

以商薯19叶片总RNA为模板，利用M-MLV反转录酶合成单链cDNA。

以单链cDNA为模板进行PCR扩增反应，回收甘薯G病毒目的片段，PCR产物进行电泳检测，利用DNA回收试剂盒获取G病毒目的基因。

1.5 目的基因的连接、转化及阳性克隆测序

将所获取的目的基因与pMD19-T载体进行连接，转化DH5α，PCR扩增，电泳检测确定为阳性的单克隆，送到上海英骏生物技术有限公司测序，并与数据库核酸序列进行比较。

1.6 脱毒苗快繁体系的建立

1.6.1 无菌芽的获得以健壮、无病斑商薯19薯块为材料，用1%高锰酸钾处理15 min，再用0.5%多菌灵浸泡1 h，捞出晾干后置于灭菌水（0.1%多菌灵）中在恒温（28 ℃）和相对湿度80%～85%条件下进行催芽。待薯芽萌发后，在35～40 ℃（8 h/d）下培养30 d。当薯芽长至10 cm左右时，用无菌解剖刀切下顶部约3 cm芽段，剪去多余的叶片，放入烧杯灭菌消毒后，利用3种不同消毒方法（表1）进行处理，进行无菌播种。

1.6.2 茎尖培养切取茎尖顶端（约1 cm），用已消毒的解剖刀在40倍解剖镜下切除较大的叶原基，用解剖针切下位于茎尖顶端的生长点。每个培养皿中分别接种3～4个。分别用3种培养基进行培养，编号A1、A2、A3，所用培养基及生长状况见表2。

1.6.3 苗的增殖莖尖30 d后可分化出苗，然后进行增殖培养，分别采用3种不同的培养基进行培养，编号B4、B5、B6，每个培养瓶中接种3～5个，所用培养基及增殖状况见表3。

1.6.4 脱毒苗根的诱导在无菌条件下，将无菌苗剪切成带有1叶1节的小段，诱导生根。采用3种不同的培养基进行生根诱导，编号C7、C8、C9，每组所用培养基配比不同，所用培养基及根的诱导情况见表4。

1.7 病毒检测

当茎尖幼苗长至6～7张叶片时，进行 RT-PCR 病毒检测，挑取6株长势较好的商薯19幼苗，编号为1、2、3、4、5、6，分别提取总RNA，检验完整性，以总RNA为模板合成单链cDNA，PCR扩增，产物经电泳检测目的条带。已经成功脱毒的幼苗可进行快速繁殖生产，将未脱毒的幼苗淘汰或进行茎尖分生组织培养再次脱毒。

2 结果与分析

2.1 G病毒基因的克隆

2.1.1 提取总RNA RNA检测结果如图1所示。28S、18S、5S条带均存在，28S约为18S亮度的2倍，说明商薯19叶片中RNA完整性很好，能够满足基因克隆的要求。

2.1.2 目的基因克隆及检测利用RT-PCR从商薯19叶片总RNA中扩增出目的片段（图2）。对其进行回收、连接、转化、PCR检测、测序，得到800 bp的DNA序列，与NCBI发表的序列相似度达到99%，说明已经获得G病毒基因序列。

2.2 甘薯脱毒苗组培快繁

2.2.1 不同表面消毒方法对茎尖成活率的影响由表1得出，外植体以处理A效果最佳，处理B的效果次之，处理C的效果最差。可见，氯化汞的灭菌效果比次氯酸钠较好，将处理A和处理B对比发现，0.1%氯化汞灭菌时间对茎尖成活率也有一定的影响。综合不同的灭菌方法的结果来看，最佳选择是处理A。

2.2.2 茎尖诱导外植体茎尖接种25 d后观察其诱导情况，在加入6-BA和NAA组合的培养基中，无菌芽尖形成绿色紧实的愈伤组织，容易分化出芽（图3）;在加入激素KT的培养基中，无菌芽尖形成黄绿色松散的愈伤组织，不容易分化出芽，说明KT的茎尖诱导效果不好;在不加激素的MS培养基中，无菌芽尖形成少量的愈伤组织，且需要的时间长，说明茎尖诱导需要加入一定量的激素，茎尖诱导的最佳培养基为1号。

2.2.3 苗的增殖茎尖愈伤组织15 d后即可分化出成苗（图4），30 d后长出6～7张叶片（图5）。从3种培养基的增殖情况可知，6-BA可有效诱导苗的增殖，但较低浓度的效果不佳，6-BA与CW的组合效果最佳，6-BA与NAA的组合不利于叶的生长，综合3种培养基中苗的长势来看，适宜增殖的最佳培养基为4号培养基，苗生长快，健壮，叶绿。

2.2.4 生根培养试验表明，NAA有利于单茎苗的诱导生根，浓度稍高的NAA效果更好。综合3种不同培养基中多数幼苗的生根情况来看，诱导生根培养基的最佳选择为7号，生根多而且健壮，有利于后期整棵植株的营养供应（图6）。

2.3 病毒检测

检测结果（图7）显示， 6株商薯19幼苗叶片的总RNA完整性很好。单链cDNA经PCR扩增及电泳检测结果见图8，编号为1、2、3、4、5的植株均无目的基因条带，说明均已脱毒成功，6号有明显的G基因条带，说明脱毒未成功，G病毒脱毒率达到83%。已经脱毒的商薯19幼苗可以进行脱毒苗快速繁殖培养，将未脱毒的幼苗淘汰或继续脱毒。

3 讨论与结论

茎尖分生组织培养技术是当前获取和培养脱毒苗的主要手段[17-18]。本研究以商薯19的茎尖为外植体，通过建立RT-PCR病毒检测体系，筛选出成功脱毒的幼苗，并初步建立了甘薯的脱毒苗组培快繁体系。本试验选取的研究对象是商薯19，建立了G检测方法和脱毒苗快繁体系。试验表明，在商薯19茎尖表面消毒过程中发现，以0.1%氯化汞灭菌6～7 min为宜，低于6 min外植体容易发生不同程度的污染，高于7 min外植体容易死亡，且0.1%氯化汞灭菌效果好于10%次氯酸钠。由于氯化汞属于重金属，使用过的氯化汞应做特殊处理[19]。

脱毒苗快繁技术的关键在于剥离的茎尖进行诱导分化，在培养基中加入适量的6-BA和NAA有利于芽的诱导分化，但要注意浓度应适中，过高或过低都不利于甘薯茎尖的诱导分化[19]。

在病毒检测过程中，应选取长势较好的商薯19幼苗来检测其脱毒是否成功，因为脱毒成功的幼苗要进行脱毒苗快速繁殖，所以要选取长势较好的幼苗，以便后代能遗传得到优良的性状，达到提高产量和质量的目的。

脱毒苗快速繁殖利用单茎苗来进行，MS培养基和1/2MS培养基是适合商薯19生根的基本培养基，在培养基中加入适量的NAA有利于单茎苗诱导生根，并且生出的根粗壮，有利于后期成苗的营养吸收[19]。

在将茎尖分化出的苗从培养皿移植到培养瓶中时，要注意轻轻夹取，避免用力过猛而损伤茎和叶[20-21]。同时试验要在乙醇灯旁操作，避免空气中的细菌污染培养基及茎尖分化组织，此外，操作时动作要快，避免乙醇灯热量灼伤茎尖分化组织。

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