气相色谱-质谱指纹图谱法研究普洱茶醇溶物挥发性成分

吴 娜，刘 卫，田先娇，杨新周

(1. 红河学院 理学院，云南 蒙自 661199；2. 云南省高校“地方特色资源利用与新材料”重点实验室，云南 蒙自 661199；3. 德宏师范高等专科学校理工学院，云南 德宏 678400)

普洱茶采用晒青毛茶为原料，经过特定发酵加工工艺制成，形褐红，汤红浓、透亮，香气独特陈香，味醇厚甘甜[1]，具有降血脂、助消化、解毒、防癌与抗癌、健齿护齿、抗衰老和美容等多种保健功效，深受消费者的喜爱[2-3]. “陈香”是普洱茶的主要特点，不同品牌、不同产地的普洱茶，其色、香、味具有不同特征. 相同产地、相同品牌的普洱茶因放置年限的不同，也会呈现出色、香、味的不同变化[4-8]. 普洱茶的这种变化被人们称之为“越陈越香”，此特点已成为引导普洱茶消费的主要指标，是普洱茶被品味及感受的主要特征.

普洱茶的香气成分是茶原料在制茶过程中进行复杂生化反应后的产物. 目前，已从茶叶中分离提取出700多种香气成分，包括醇、醛、酮、酯、酸、氮和氧杂环化合物等[3]. 20世纪70年代开始应用指纹图谱技术控制药物质量. 指纹图谱的研究已涉及多种方法，包括色谱法、光谱法、气质联用以及液质联用等技术. 其中色谱法为主流方法，已成为公认的常规分析手段. 目前，指纹图谱技术已在环保、石油加工、食品药品质量控制、电子技术和生物化工等领域得到广泛的应用[9-10]. 茶叶指纹图谱研究是一种综合、可量化的鉴定手段，它是建立在化学成分系统研究的基础上，主要用于评价茶叶质量的真实性[11]，包括获得图谱信息和图谱信息处理. 通过对图谱信息解读、比较、判断，可以从大量指纹图谱数据中得到有关规律.

目前，以外观、口感、视觉等为主的描述性质量评价无法满足同产地的普洱茶其色、香、味的不同特征. 相同产地、相同品牌的普洱茶放置需求也受主观人为因素影响较大，缺乏统一的定性定量评价标准. 再者，因品牌、年限的差异，普洱茶也会呈现出色、香、味的不同变化. 因此，以中国驰名商标大益普洱茶中销量最大的生茶7542为研究对象，建立普洱茶7542醇溶物挥发性成分气相色谱-质谱(GC-MS)指纹图谱的方法. 对指纹图谱进行相似度计算和主成分分析，为普洱茶7542提供鉴别信息丰富的检测方法，利于促进普洱茶产业的提质升级，促进普洱茶的持续健康发展.

1 试验部分

1. 1 仪器与试剂

GC-MS-QP 2010气相色谱-质谱联用仪(日本岛津公司)，毛细管柱：Rtx-5Ms(30.0 m×0.25 μm×0.25 mm)、Rtx-35(30.0 m×0.25 μm×0.25 mm)、Rtx-1(30.0 m×0.25 μm×0.25 mm)，旋转蒸发仪(EYELA OSB-2100)，超声波清洗器(HS-3120，环保仪器厂)，数显电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，循环水式多用真空泵(SHZ-D(Ⅲ)，天津华鑫仪器厂)，无水乙醇(AR，天津市风船化学试剂科技有限公司).

1. 2 试验方法

1. 2. 1 供试样品

不同年限、不同批次的10个普洱茶生茶7542样品均来自于勐海茶厂，年限及批次如表1所列，其中106为参考样，其它均为比对样. 将样品于研钵中研细，过0.3 mm筛，密封储存于广口瓶中.

1. 2. 2 检测条件

GC条件：柱箱温度150 ℃；进样口温度230 ℃；分流比15∶1；柱流量0.57 mL/min；总流量12.1 mL/min；吹扫流量3.0 mL/min；载气氦气，纯度99.999%；毛细管柱Rtx-5MS；程序升温150 ℃保持1 min，再以2 ℃/min 升至230 ℃，并保持10 min，总运行时间55 min.

表1 普洱茶样品信息Table 1 Sample informations of Pu-erh tea

MS条件：离子源温度200 ℃；接口温度230 ℃；检测器电压0.88 kV；溶剂延迟时间5 min；质量数扫描范围：40～800.

静态顶空(HS)进样条件：进样针体积2.5 mL；进样体积1.0 mL；振荡箱温度110 ℃；振荡时间20 min；振荡速度250 r/min；气体吹针时间3 min；进样速度500 μL/s；气相运行时间55 min；压力1 Pa.

1. 2. 3 样品溶液的制备

准确称取1.000 g样品，加入质量分数为95%的乙醇50 mL，使用超声提取30 min，过滤，于旋转蒸发仪上浓缩至10 mL，过滤至顶空进样瓶，得样品溶液.

1. 2. 4 数据处理

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004(A)版》和SPSS 19.0软件处理.

2 结果与讨论

2. 1 提取液体积的选择

称取1.000 g 106样品三份，分别加入20、30、50 mL 95%的乙醇溶液，超声提取30 min，过滤，于旋转蒸发仪上浓缩至10 mL，过滤至顶空进样瓶，上机测定，考察不同乙醇体积对醇提物成分的影响. 试验结果表明：采用50 mL乙醇提取的成分相对较多，各成分的峰面积相对均匀. 采用30 mL乙醇提取的成分峰面积相对较大，但是成分相对少且基线不平稳. 因此，最佳提取液体积为50 mL.

2. 2 超声提取时间的选择

称取三份106样品1.000 g样品，加入50 mL 95%的乙醇溶液，分别超声提取10、20、30、40、60 min，过滤，于旋转蒸发仪上浓缩至10 mL，过滤至顶空进样瓶，上机测定. 探讨提取时间对醇溶物成分的影响. 试验结果表明：提取时间选择30、40、60 min时，色谱峰比提取10、20 min时较多，但这三者之间的色谱峰数目变化不大. 提取时间选择20 min时，成分相对较少，而且仅有三种主要成分. 提取时间选择10 min时，提取的成分多，但是各成分的峰面积值相对较小. 因此，普洱茶7542醇溶物挥发性成分的超声提取时间为30 min.

2. 3 HS振荡箱温度的选择

称取7份1.000 g 106样品，加入50 mL 95%的乙醇溶液，超声提取30 min，过滤，于旋转蒸发仪上浓缩至10 mL，过滤至顶空进样瓶. 设置HS的振荡箱温度为60、70、80、90、100、110、120 ℃，探讨温度对普洱茶7542醇溶物挥发性成分的影响. 试验结果表明：普洱茶7542醇溶物挥发性成分的HS振荡箱温度选择110 ℃时，其色谱峰较多，且峰高较大.

2. 4 振荡时间的选择

称取4份1.000 g 106样品，加入50 mL 95%的乙醇溶液，超声提取30 min，过滤，于旋转蒸发仪上浓缩至10 mL，过滤至顶空进样瓶. 设置HS振荡时间为10、15、20、30 min，探讨振荡时间对普洱茶7542醇溶物挥发性成分的影响. 试验结果表明：普洱茶7542醇溶物挥发性成分的HS振荡时间选择20 min时，色谱峰数目较多，且峰高较大.

2. 5 不同年限、不同批次普洱茶7542系列样品醇溶物挥发性成分指纹图谱的建立

将不同年限、不同批次的普洱茶7542系列504、505、606、608、703、801、810、901、912样品各称取1.000 g，加入50 mL 95%乙醇超声提取30 min，顶空进样条件：振荡箱温度110 ℃，振荡时间20 min，浓缩至10 mL，过滤至顶空进样瓶，测定. 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004(A)版》软件对数据进行处理，建立了不同年限、不同批次的普洱茶7542醇溶物挥发性成分的GC-MS指纹图谱，结果如图1所示.

图1 不同年限、不同批次的普洱茶7542系列样品醇溶物挥发性成分GC-MS指纹图谱从下往上依次为504、505、606、608、703、801、810、901、912、R(106)Fig. 1 GC-MS fingerprints of volatile components of alcohol-solute in Pu-erh tea 7542 series sample of different ages and batchesFrom bottom to top: 504、505、606、608、703、801、810、901、912、R(106)

2. 6 普洱茶7542系列样品醇溶物挥发性成分指纹图谱分析

2. 6. 1 相似度分析

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004(A)版》软件对普洱茶7542系列样品醇溶物挥发性成分GC-MS指纹图谱进行相似度分析，选用普洱茶7542(106)作为参照图谱，计算所有样品的相似度，结果如表2所列.

表2 普洱茶7542系列样品醇溶物挥发性成分指纹图谱相似度Table 2 Similarity of fingerprints of volatile components of alcohol-solute compounds in Pu-erh tea 7542 series samples

由表2可知，相似度不低于0.900的样品是606、608、901、912，相似度不低于0.800并且不高于0.900的样品是505、810，相似度不低于0.700并且不高于0.800的样品是504、703、801，而样品606、608、901、912和106的谱峰相似度较高，样品505、810和106的谱峰相似度有略微的差异，样品504、703、801和106的谱峰相似度差异较大，说明不同年限、不同批次的9个普洱茶7542醇溶物挥发性成分和参照样本相比发生了改变，但变化的幅度不大.

2. 6. 2 主成分分析

对普洱茶7542系列样品醇溶物挥发性成分GC-MS指纹图谱进行积分，选择峰面积百分含量大于0.1%的峰为挥发性成分，普洱茶7542系列样品醇溶物中共有挥发性成分12个，其信息如表3所列. 将表3数据导入SPSS 19.0软件中进行选降维-因子分析和最大方差法分析，其结果如表4所列.

表3 普洱茶7542系列样品醇溶物挥发性成分共有峰面积百分含量Table 3 Percentages of common peak area of volatile components of alcohol-solute compounds in Pu-erh tea 7542 series samples

表4 普洱茶7542系列样品醇溶物挥发性成分主成分全部方差解释Table 4 Principal component variance values of volatile components of alcohol-solute substances in Pu-erh tea 7542 series samples

由表3可看出，2-羟甲基-2-甲基-吡咯烷-1-甲醛、N-丁基苯磺酰胺、咖啡因、3-羟基月桂酸、不饱和脂肪酸、邻苯二甲酸单乙基己基酯和抗坏血酸榈酸酯的峰面积百分含量相对较大，9个不同年限、不同批次普洱茶7542醇溶物中12个挥发性成分峰面积百分含量有差异，其中2007年第3批和2008年第1批12个挥发性成分峰面积总量较大，是2008年第10批峰面积总量的2倍多，说明同年不同批次的普洱茶7542醇溶物挥发性成分含量有差异，可用普洱茶7542醇溶物挥发性成分鉴别和评价不同年限不同批次的普洱茶7542.

由表4可知，9个不同年限、不同批次普洱茶7542醇溶物挥发性成分中共提取了2个成分，即2-羟甲基-2-甲基-吡咯烷-1-甲醛和N-丁基苯磺酰胺，其特征值大于1，累计方差贡献率达90.2%. 因为2个主成分的累计方差贡献率大于80%，所以能较好的代表9个不同年限、不同批次普洱茶7542的全部信息，可以用主成分分析来反映样品的全部信息，可测定9个不同年限、不同批次普洱茶7542醇溶物中2-羟甲基-2-甲基-吡咯烷-1-甲醛和N-丁基苯磺酰胺的含量差异评价普洱茶7542的质量.

3 结论

论文以普洱茶7542为参考样本，乙醇为溶剂，超声提取制备普洱茶醇溶物，建立了普洱茶7542醇溶物气相色谱质谱(GC/MS)指纹图谱，同时对其指纹图谱进行相似度计算和主成分分析. 试验结果表明，普洱茶7542醇溶物的最佳提取方法是采用50 mL 95%乙醇超声提取30 min，顶空进样条件为振荡箱温度110 ℃，振荡时间20 min. 对9个不同年限、不同批次的普洱茶7542系列样品醇溶物挥发性成分GC-MS指纹图谱的相似度分析和主成分分析可知，测定样品醇溶物挥发性成分图谱与对照图谱之间的相似度在0.706～0.906之间，说明不同年限、不同批次的9个普洱茶7542醇溶物挥发性成分和参照样本相比发生了改变，但变化的幅度不大，但共有成分峰面积百分含量存在差异. 特别是2007年第3批和2008年第1批，12个挥发性成分峰面积总量较大，分别是77.55%和80.39%，是2008年第10批峰面积总量的2倍多，说明同年不同批次的普洱茶7542醇溶物挥发性成分含量有差异. 对测定样品醇溶物挥发性成分进行主成分分析，9个不同年限、不同批次普洱茶7542醇溶物挥发性成分中共提取了2个成分，即2-羟甲基-2-甲基-吡咯烷-1-甲醛和N-丁基苯磺酰胺，其特征值大于1，累计方差贡献率达90.2%，因为2个主成分的累计方差贡献率大于80%，所以能较好的代表9个不同年限、不同批次普洱茶7542的全部信息，可以用主成分分析来反映样品的全部信息，可测定9个不同年限、不同批次普洱茶7542醇溶物中2-羟甲基-2-甲基-吡咯烷-1-甲醛和N-丁基苯磺酰胺的含量差异评价普洱茶7542的质量.