库尔勒香梨果实香气代谢过程中相关酶类活性变化研究

2021-01-07张军，姚虹

中州大学学报 2020年6期

张军，姚虹

(郑州工程技术学院 a.化工食品学院; b.分析检测中心，河南郑州 450044)

梨(Pyrusspp.Rosaceae)果实具有独特的香气，是构成梨的品质特征的重要因素[1]。香气物质是在植物生长过程中经过一系列酶促反应形成的各种挥发性化合物[1-2]，是植物的次级代谢产物，其前体物质为碳水化合物、脂肪酸、氨基酸。果实香气的形成是一个动态的过程,不同发育阶段果实中的关键酶活性不同，所产生的香气物质也不同。一般在果实中香气物质分子可以分为有机酸脂类、醛类、醇、酮、挥发性萜类杂环类化合物等[3]。对果实香气特征贡献大的香气物质称为果实特征香气物质，即能使果实呈现特有香味的一类挥发性物质[4]。各种挥发性香气小分子来源路径各不相同[5]。

脂氧合酶(LOX)途径形成大量的直链脂肪族醇、醛、酮和酯类物质[6]。果实中大量不饱和脂肪酸(亚油酸、亚麻酸)被专一的、高活性脂氧合酶氧化产生一系列小分子醇、酸等，构成了果实脂类香气的主体，还参与了C6己醛和己烯醛的合成[7]，这些化合物对果蔬的“新鲜”风味有重要贡献[8]，如柑橘中的(E)-3-己烯醇和己醛[9-10]。番茄在不同的成长阶段有特征的挥发性香气成分物质，成熟时有以C6分子的己醇、己醛、(Z)-3-己烯醛等为特征的新鲜风味物质[11]。不饱和脂肪酸经脂氧合酶途径生成氢过氧化物，逐步经过氧化、裂解及脱氢作用转化成相应的醛类和醇类，进一步形成酯类等。LOX是脂肪酸代谢途径中的关键酶，在香气物质形成过程中醇脱氢酶(ADH)、醇酰基转移酶(AAT)等也起到重要作用[12]。

醇酰基转移酶(AAT)是氨基酸代谢途径产生支链脂肪族醇、醛、酮和酯类物质的关键限速酶。果实中有部分氨基酸在转氨酶的作用下，通过氨基转移作用形成了支链酮酸，支链酮酸与辅酶A(Co-AS)作用生成了酰基Co-AS，然后在AAT的作用下生成酯[13]。该途径参与香气小分子代谢合成的氨基酸主要有丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸和亮氨酸等。AAT是氨基酸代谢途径酯类形成过程中的关键酶[14]，它催化酰基辅酶A中的酰基并转到相应的醇，为下一步酯类合成准备了充足的原料。其中丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸为甲基支链酯合成的前体物质。部分果实中的酯香型、果香型特征香气成分是通过氨基酸代谢途径产生的，如柑橘[15]。

醇脱氢酶(ADH)在LOX途径中主要依赖NAD, 广泛参与直链醛、支链醛、芳香醛等与对应醇之间的转化，是植物香气物质合成中最重要的酶。在氨基酸代谢中，氨基酸在脱羧酶作用下生成醛，然后在醇脱氢酶的作用下生成酸。另外，单糖经无氧代谢产生丙酮酸，在ADH作用下氧化脱羧形成乙酰辅酶A,进而合成某酸乙酯或乙酸某酯等[16]。

β-葡萄糖苷酶(CB)作用下的键合态香气也是水果香气的重要组成部分，作为一种潜香型化合物，与植物中的糖类物质通过糖苷键结合形式存在于植物中，一般是β-D-葡萄糖[17]，不具挥发性，在酸或酶的作用下水解释放后，从水果中挥发出来，可以被人们感受到，这种相对直接被人们感受到的香气就是自由态香气[18]。目前有人研究认为，键合态香气的数量和种类在个别水果中远高于自由态香气[19]，它们共同作用，构成了水果的基本风味和特征香气[20]。因此，β-糖苷酶作为外源的水解酶，已被广泛确认能够水解植物中的键合态香气的糖苷键，使香气得到释放[21]。

库尔勒香梨以独特而浓郁的香味著名，怡人的果实香气可以吸引消费者并增强果品的市场竞争力。近年来，人们对果品香气及贮藏过程中内容物质变化越来越关注，但对库尔勒香梨果实香气的形成和衰减生理机制的研究分析很少，尤其是对库尔勒香梨香气成分与相关酶的相关性的研究鲜有报道。以库尔勒香梨为试验材料，对其挥发性香气相关酶活性进行系统研究，旨在阐明库尔勒香梨果实挥发性物质代谢调控机理，也为今后新疆梨品种选育、栽培管理、采后贮藏、果实品质改善等技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料来自新疆库尔勒沙依东园艺场梨园(北纬41°43′56″，东经86°1′59″；北纬41°43′17″，东经86°2′18″)，25年左右树龄香梨树(间种授粉树为砀山梨)，采样时间选在中午(1200～1400)进行，选择生长正常、无病害的库尔勒香梨植株果实。每隔30天左右采样一次，冰盒冰鲜运至昌吉市实验室，放置于-80℃冰箱超低温保存备用。

1.2 试剂与仪器

氢氧化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、正丁醇、盐酸、氯化镁、乙醛、柠檬酸、石英砂：均为分析纯，天津市福晨化学试剂有限公司；亚油酸、Tween 20、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、交联聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、TritonX-100、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、对硝基苯基-β-葡萄糖苷(pNPG)、对硝基苯酚(PNP)、2-吗啉乙磺酸(MES)、二硫苏糖醇(DTT)：上海麦克林生化科技有限公司；尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、乙酰-CoA：罗氏(中国)有限公司；水：色谱纯。

UV-2450紫外可见分光光度计：日本岛津公司；BS210S电子天平：德国Sartorius 公司；冷冻离心机：德国Eppendorf公司；HHS-1电热恒温水浴锅：上海齐欣科学仪器有限公司；W-HL328超低温冰箱：中科美菱低温科技有限责任公司；GL-4L冷藏保温箱：广州佳冷冷藏科技有限公司；移液器：大龙兴创实验仪器(北京)有限公司；10 L液氮罐：查特生物医疗(成都)有限公司。

采用 Excel 进行实验数据处理分析，使用 origin 9.0 作图。

1.3 不同时期库尔勒香梨果实中LOX酶活性测定

参照詹萍[22]，Liburdi[23]等方法并做适当修改。

反应底物：在溶有0.1 g Tween 20重蒸水中加入50 μL亚油酸，用NaOH溶液(1 mol/L)滴定至澄清，调节pH在9.0左右，用重蒸水定容至25 mL，冷藏备用。

粗酶液提取：称取10.0 g库尔勒香梨，立即在液氮下研磨成粉末，加入1.0 g PVP，5 mL预冷的0.005 mol/L磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液(pH 7.0)，5mL TritonX-100(1% )，冰浴环境研磨成匀浆，在0℃下于7000 r/min离心30 min，上清液在4 ℃下于7400 r/min离心15 min，取出上清液，并用相应的缓冲液定容至10 mL，即得粗酶液，4 ℃保存备用(-30℃冰箱保存)。

LOX酶活性测定：酶反应体系为3 mL，包括2.88 mL pH 7.0磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液(0.05 mol/L)，0.1 mL亚油酸反应底物和0.02 mL酶液。反应体系加入酶液后倒转3次(15 s左右)，于室温下在波长234 nm处测定吸光度的变化值，即ΔOD234(每隔20 s记录一次吸光值，共记录3 min)。酶活力以每分钟吸光值变化0.001为一个活性单位。

空白对照：按上述方法处理加热失活的粗酶液,作为空白对照。

1.4 不同时期库尔勒香梨果实中ATT酶活性测定

本方法参照Fellman[24]，张晓萌[25]等并做适当修改，稍加改进。

反应底物：10mmol/L正丁醇。

粗酶液的提取：取3 g果肉，加0.1 g PVPP和6 mL 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)，在冰浴环境充分研磨成匀浆，在4℃下于16000 r/min离心30 min，上清液用于酶活性的测定。

酶活性测定：反应体系由2.4 mL的0.5 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.0)，11.6 mmol/L MgCl2，0.3 mmol/L 乙酰-CoA，10 mmol/L 正丁醇和0.6 mL酶液组成。各组分混合后置于 35℃水浴15 min，然后添加150 μL 10 mmol/L DTNB，在室温下放置10 min，用紫外分光光度计在412 nm下测定吸光值，重复3次。酶活性以ΔOD412表示，酶活力以每分钟吸光值变化0.001为一个活性单位。

空白对照：按上述方法处理加热失活的粗酶液，作为空白对照。

1.5 不同时期库尔勒香梨果实中醇脱氢酶ADH活性测定

本方法参照Longhurst T J[26]，A Echeverría G[27]等方法，做适当修改并改进。

反应底物：0.15mL的0.08 mol/L乙醛。

粗酶液的提取：取3.0 g果肉冷冻组织，液氮充分研磨呈粉末状，加入6 mL经预冷(4℃)的提取液，组成如下：0.1 mol/L MES-Tris缓冲液(pH 6.5)，2mmol/L DTT，1% PVP。充分混匀、浸提，4℃下于15000 r/min离心30 min，上清液用于ADH活性测定。

酶活性测定：3 mL反应体系由2.4 mL的MES-Tris缓冲液(pH 6.5)，0.15 mL的l.6 mmol/L NADH，0.15 mL的0.08 mol/L乙醛和0.3 mL的粗酶液组成，反应温度为30℃，于340 nm下测定ADH活性。加酶液后15 s开始计时，记录1min内吸光度OD值变化，重复3次。酶活力以每分钟吸光值变化0.001为一个活性单位。

空白对照：按上述方法处理加热失活的粗酶液，作为空白对照。

1.6 不同时期库尔勒香梨果实中β-葡萄糖苷酶CB活性测定

本方法参照詹萍[28]、李华[29]等方法，做适当修改并稍加改进。

粗酶液提取：称取10.0 g库尔勒香梨，立即在液氮下研磨成粉末，加入1.0 g PVP，0.2 g 石英砂，5 mL预冷的0.05 mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH 6.0)，冰浴环境研磨成匀浆，4℃下于10000 r/min 离心20 min ，上清液4℃下于14400 r/min 离心10 min，取出上清液，并用缓冲液定容至10 mL，得粗酶液。其余保存在-30℃冰箱中备用。

活性测定：在10 mL具塞试管中依次加入0.6 mL 缓冲液、1.0 mL 粗酶提取液和 0.2 mL 10 mmol对硝基苯基-β-葡萄糖苷，迅速盖上试管塞，立即放至35℃水浴中，反应60 min后立即加入 2.5 mL 1 mol/L Na2CO3溶液终止反应，在对硝基苯酚的最佳吸收波长400 nm处测吸光值。

空白对照：0.2 mL的10 mmol pNPG用0.2 mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH6)代替酶粗提液，其他同上。

对硝基苯酚标准曲线：准确称量对PNP(WM139.1)139.0 mg，用蒸馏水定容至1 L。分别吸取1，2，3，4，5，6 mL溶液至100 mL容量瓶中，用l mol/L Na2CO3溶液定容后混匀。使1 mL稀释液中分别含有对硝基苯酚0.01，0.03，0.05 μmol，利用对硝基苯酚的标准曲线方程计算出所生成的对硝基苯酚的浓度。

2 结果与分析

果实香气是果实性状之一，性状的产生和表现受到各种酶的控制[30]。本研究选择的果实香气合成代谢的4种关键酶类，即LOX，ATT，ADH和CB在库尔勒香梨香气合成代谢过程中活性变化各有特点，具体说明如下。

2.1 库尔勒香梨果实不同时期脂氧合酶LOX活性变化

LOX途径是果实香气脂肪酸代谢途径初始过程中重要的限速酶，决定LOX途径的顺利进行，为后续的转化过程提供底物，它与植物的器官发育及果实成熟有很大关系[31]。

由图1上可见，库尔勒香梨果实从花后1个月左右LOX酶活力为ΔOD2340.0094g-1·min-1，开始缓慢增加，在7月份猛然到达最大ΔOD2340.0724g-1·min-1，然后LOX酶活性开始下降。从活性变化趋势线上看总体呈现下降趋势，这与果实中LOX作用底物有关[32]，在植物膜脂中富含的亚油酸和亚麻酸是其主要的反应底物[33]。在香梨成熟采摘后10月份至12月份活性一直平缓下降。

图1 香梨果实不同时期LOX酶活性变化

2.2 库尔勒香梨果实不同时期ATT活性

在香梨发育及其货架期，ATT的活性变化总体趋势倾斜向上，与ATT活性变化趋势走向相反，但是从走势图上看，变化总体上与LOX活性变化相类似。AAT是催化LOX酯类合成的最后一步，是参与酯类途径中的最终限速酶，是氨基酸代谢的关键酶，它可以催化醇类底物与酰基-CoA 酯化为相应的酯类物质[34]，从而生成果实酯类香气成分中的特征香气。

由图2可见，香梨果实从花后1个月左右ATT活力为ΔOD4120.012g-1·min-1，6月份稍微缓慢降低至ΔOD4120.0102g-1·min-1，然后开始抬升，至9月份到达最大ΔOD4120.0227g-1·min-1，然后到达10月份ATT活性开始平缓下降至12月份。在香梨果实发育前期活性变化不稳定，但随着果实成熟逐渐升高随后下降至平缓。

图2 香梨果实不同时期ATT酶活性变化

2.3 库尔勒香梨果实不同时期ADH活性

香梨果实生长发育过程中，ADH活性变化较大。参与植物体内各种醇类与相应醛类物质之间的相互转化反应[35]。从图3可见，ADH活性从香梨果实花后1个月左右从最低点ΔOD3400.0029g-1·min-1开始剧烈增高，7月份达ΔOD3400.0346g-1·min-1后开始缓慢下降。8月份至10月份ADH酶活降低较为平缓，从ΔOD3400.0280g-1·min-1缓慢降至ΔOD3400.0256g-1·min-1，从香梨生理上说，这段时间香梨开始成熟，果园一般9月份至10月份开始采摘。ADH酶活平稳，说明在香梨果实内香气的LOX途径、氨基酸途径和糖代谢途径生化反应进行平稳，合成和代谢进入平台期。此后香梨果实ADH活性又降低迅速，11月份降至ΔOD3400.0129g-1·min-1，继续降低至12月份ΔOD3400.0107g-1·min-1。

图3 香梨果实不同时期ADH酶活性变化

2.4 库尔勒香梨果实不同时期CB活性

研究CB，即研究β-葡萄糖苷酶活性，目的在于分析和寻找键合态香气产生的机理及其与自由态香气的关系。植物中多种次级代谢产物的糖基化复合物，相对应的，植物中必然存在着能够催化这些次级代谢产物糖苷的葡萄糖苷酶[36]。因此实验以对硝基苯酚做标准曲线，得标准曲线方程y=0.05253x-0.0003，相关系数R2=0.99989，考察β-糖苷酶的活性，说明相关性极好。通过标准曲线检测香梨坐果1个月后(5月中旬)的CB活性为ΔOD4000.1705g-1·min-1，变化如图4所示继续升高，在6月中旬达到ΔOD4000.1990g-1·min-1，从整个动态图上看6月份β-葡萄糖苷酶活性最高，并且以此为拐点开始下降，8月份降至ΔOD4000.044g-1·min-1，此后下降趋势平缓，从8月份到11月份的变化很小。至货架期12月份则降至ΔOD4000.014g-1·min-1。香梨果实整个发育生长阶段以致货架期(保存3个月，10月中旬采收，12月中旬最后一次检测)β-葡萄糖苷酶活性呈现下降趋势，在果实膨大期(6月份)达到最大，随后开始持续下降。总体趋势与前人对京白梨研究一致[31]。但有些许差异，有待进一步考证。

图4 香梨果实不同时期CB酶活性变化

3 讨论

一切生命活动都是在酶的参与下进行的[37]。果实的香气物质(芳香性挥发物质)是由果实组织中一些前体物质(包括糖、氨基酸、脂肪等)在酶的作用下通过特殊的代谢合成途径形成的[38-39]。不同的途径酶的作用不同，但是生物的代谢途径是错综复杂的，某种酶既是这个途径的限速酶，也可能是另一个代谢途径的关键酶[40]。在果实(植物)组织中参与香气合成的关键酶主要有脂氧合酶(LOX) 、醇脱氢酶(ADH) 和醇酰基转移酶(AAT) 等，而β-葡萄糖苷酶近年来成为与香气代谢相关的研究热点，如范刚[20]、何芒芒[21]等对柑橘生长发育过程中β-葡萄糖苷酶的活性做了系统研究。

本文在总结前人研究的基础上，重点研究了LOX，ADH，ATT和CB等与香梨果实最相关的4种酶类，其中前3种酶和果实的自由态香气相关较为紧密，CB主要目的在于分析香梨生长发育过程中键合态香气的代谢规律。从4种酶活性趋势线来看，LOX，ADH和CB在香梨花后1个月左右至货架期(2～3个月)总体是先高后低，倾斜向下，变化幅度较大；而ATT变化趋势则与上述3种酶相反，酶活性变化出现先低后高的现象。另外，4种酶的活性变化最高点不一定是香梨最佳采摘期，这与前人对其他果实相同酶活性变化的研究结果不一致[20-21, 31, 41]，变化基本都在香梨最佳采摘期前，即果实的膨大期；酶活性变化趋势与前人研究结果相似。