尼古丁诱发动脉粥样硬化机制的最新研究进展#

2021-01-07林泽帆高分飞

四川生理科学杂志 2021年1期

林泽帆高分飞

（1.汕头大学医学院临床医学系，广东汕头 515041；2.汕头大学医学院药理学教研室，广东汕头 515041）

大量证据表明吸烟与多种疾病有关，包括恶性肿瘤、心肺疾病和脑血管意外等[1-3]。据世界卫生组织估计，吸烟导致全球每年大约6万人死亡，预计死亡人数将在2030年增加到800万[4]。为了解烟草相关疾病的病理生理学机制，并阐明烟草烟雾引起疾病的机制，全世界在过去的几十年中进行了广泛的研究。

在心血管疾病日益成为健康重要杀手的今天，吸烟与心血管疾病的关系也成为了研究的重要课题之一。在一项研究吸烟与外周动脉疾病的荟萃分析中，与吸烟相关的外周动脉疾病的RR值为2.71（95%CI：2.28-3.21，P<0.001）[5]。研究发现吸烟显著增加了急性冠状动脉和脑血管疾病（包括心肌梗塞、中风和猝死）的风险。另外也有研究表明吸烟会加速冠状动脉、主动脉、颈动脉和脑动脉以及外周循环中产生早期动脉粥样硬化[6]。

传统香烟烟雾包含的成分达到7,000种以上，其中尼古丁是主要成分[7]。在美国一项国家肺部筛查试验中发现，与非尼古丁依赖性吸烟者相比，尼古丁依赖性吸烟者发生动脉粥样硬化的OR值为0.24（95%CI 为0.08至0.69），说明尼古丁依赖是引起动脉粥样硬化的独立危险因素[8]。烟草中的尼古丁进入人体后通过作用于烟碱乙酰胆碱受体（Neuronal nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs)而发挥作用。相关研究表明，nAChRs在心血管系统几乎所有细胞（包括内皮细胞、巨噬细胞、T细胞等）中普遍表达，且非神经元nAChRs（如血管nAChRs）与中枢神经系统中的nAChRs结构极为相似[9-12]。尽管已有研究探讨了吸烟与动脉粥样硬化之间的联系，但尼古丁促动脉粥样硬化作用的机制在很大程度上仍是推测性的。本文将就近年来有关尼古丁诱发动脉粥样硬化机制的研究进展做一综述。

1 动脉粥样硬化成因

动脉粥样硬化是一种常见的血管慢性疾病，其会导致位于大中型动脉的内膜出现动脉粥样斑块等局灶性病变。低密度脂蛋白（Low Density Lipoprotein，LDL）在内皮下滞留及其氧化修饰是动脉粥样硬化的最初原因，氧化的低密度脂蛋白（Oxidized low density lipoprotein，Ox-LDL）通过诱导介导白细胞（单核细胞和T细胞）滚动和粘附的几种细胞表面粘附分子的表达来激活内皮细胞。当内皮细胞被激活时，其会表达P-选择素（P-selectin）、血管粘附分子1（Vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）、单核细胞趋化蛋白-1（Monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、白介素-8（Interleukin-8，IL-8）、细胞间粘附分子-1（Intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）、E-选择素（E-selectin）和其他炎症因子，吸引众多淋巴细胞和单核细胞与内皮细胞结合并渗入动脉壁中[13]，其中单核细胞分化为巨噬细胞，并吞噬Ox-LDL形成泡沫细胞（早期脂肪条纹病变的标志）。激活的内皮细胞和巨噬细胞可分泌多种化学因子和生长因子作用于相邻的平滑肌细胞，诱导其在内膜中增殖并合成细胞外基质，从而产生纤维斑块[14]。在晚期动脉粥样硬化中，大量巨噬细胞和其他炎性细胞因子渗入血管壁中，巨噬细胞可通过分泌基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMP）降解斑块中的胶原纤维并导致斑块破裂、出血和血栓形成[13]。

2 尼古丁对细胞功能的影响

2.1 尼古丁与内皮细胞功能障碍

血管内皮细胞是各种生理刺激的重要整合者和转化者，积极参与血管收缩-舒张、凝血-抗凝血等生理过程。由于内皮细胞在调节血管稳态中的关键作用，内皮损伤引起的内皮功能障碍通常是血管疾病发展的最早事件。大中动脉壁内皮细胞功能障碍是导致动脉粥样硬化性心血管疾病的局部和全身表现的重要因素。

完整的内皮屏障取决于细胞骨架的收缩和内皮细胞间连接的完整性，这两者都可能受到尼古丁的影响。内皮细胞屏障受肌动蛋白/肌球蛋白细胞骨架的严格调控，骨架的收缩由肌球蛋白轻链激酶（Myosin light chain kinase，MLCK）和Rho激酶（Rho kinase enzymatic activities）活性共同控制[15]。研究表明，尼古丁可以作为传统香烟烟雾或电子烟烟雾的一部分在循环系统中吸收，并通过氧化应激激活P38丝裂原活化蛋白激酶（P38MAPK），进而导致神经酰胺释放引起内皮屏障功能障碍，这是Rho激酶激活和细胞收缩的上游通路[16]。进一步研究表明尼古丁主要通过内皮细胞Rho激酶依赖性磷酸化作用抑制肌球蛋白磷酸酶1亚基（Myosin phosphatase target subunit 1，MYPT1），从而促进肌球蛋白轻链（Myosin light chain，MLC）磷酸化，增加肌动球蛋白的收缩信号达到破坏内皮屏障的作用[17]。而内皮间连接是由许多连接蛋白构成，包括紧密连接蛋白ZO-1/2（ Zonula occludens-1/ zonula occludens-2 ，ZO-1/2）。连接蛋白表达下降可能导致内皮间连接完整性的下降，因此被认为是导致内皮屏障功能障碍和内皮通透性过高的标志性事件[18，19]。共聚焦显微镜分析表明，服用尼古丁的小鼠可出现内皮间紧密连接破坏，表现为冠状动脉内皮细胞ZO-1和ZO-2表达减少，而ZO-1/2减少可被Nlrp3炎性小体（ Nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat pyrin domain containing 3，NLRP3）基因缺陷阻止，其具体机制是尼古丁诱导内皮细胞溶酶体的损伤和组织蛋白酶B的释放，进而促进Nlrp3炎性小体的聚集和激活以及炎性小体依赖性释放的介导炎症的高迁移率族蛋白B1 (High-mobility group box 1 protein，HMGB1)的表达[20]。最近的研究表明，HMGB1可通过晚期糖基化终末产物（RAGE）受体激活MAPK信号通路引起MMP-2和MMP-9过表达以及紧密连接蛋白ZO-1和紧密连接蛋白-5的表达降低进而增大内皮通透性，这表明Nlrp3炎性小体-HMGB1信号轴的激活可能是吸烟相关血管并发症早期发展的重要触发机制[21，22]。

在动物实验中，饮食诱导的肥胖大鼠长期口服尼古丁后主动脉出现肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）表达增加而一氧化氮合酶（Endothelial nitric oxide synthase，eNOS）表达降低，且经尼古丁干预的肥胖大鼠腹膜巨噬细胞培养液可抑制内皮细胞eNOS表达并增加内皮细胞NADPH亚基gp91phox和p22phox的表达，这表明内皮功能障碍、血管氧化应激和血管炎症与巨噬细胞释放炎症因子有关。[23]另外，经qRT-PCR和western blot检测尼古丁可诱导人脐静脉内皮细胞核转录因子肽NF-κB p65表达水平和核移位明显增加。以往的研究已表明核转录因子NF-κB信号通路是炎症的核心调控因子，其可以促进IκB激酶β（Inhibitor kappa B kinaseβ，IKKβ）、核因子kappaB p65（NF-κB p65）和抑制性κB蛋白（Ikppa Bα，IkBα）的表达[24]。

2.2 尼古丁与血管平滑肌细胞表型转化、迁移

作为血管的组成成分，VSMC在动脉粥样硬化形成中扮演重要角色。越来越多的证据表明，在局部微环境中，VSMC对损伤性刺激具有显著的表型可塑性。[25]。随着病变的发展，VSMC向内膜的迁移和增殖有助于纤维帽的形成[26]。同时VSMC会通过自分泌或旁分泌的方式分泌促炎、促增殖细胞因子激活VSMC并将巨噬细胞募集到损伤部位[27]。最新研究还认为VSMC可通过其细胞膜表面表达的脂蛋白受体摄取脂质，形成肌源性泡沫细胞[28]。

2.2.1 VSMC表型转化

在正常状态下，VSMC增殖水平低，并具有低合成活性。然而，在发生动脉粥样硬化慢性炎症时，VSMC可发生异常调节，导致斑块区VSMC脱分化，VSMC可从收缩型转变为合成型，即发生表型转化，从而获得再增殖能力，并在增殖的同时合成与分泌大量细胞因子和细胞外基质[29]。

Yoshiyama等人研究发现经尼古丁处理的VSMC同工型肌球蛋白和肌动蛋白的表达水平表现出相似趋势。合成型VSMC标志物（肌球蛋白II 10和β-肌动蛋白）的蛋白质水平增加，并且收缩型VSMC标志物（肌球蛋白II 11和α-肌动蛋白）表达没有显著变化[30]。而在Wang等人的研究中，经过尼古丁处理36 h的VSMC中α-肌动蛋白和平滑肌22α的mRNA水平降低约50%，而合成型VSMC标志物骨桥蛋白的合成上调1.5倍[31]。另外在一项相关研究中发现尼古丁处理可将VSCM胶原蛋白的表达提高2.1倍，而胶原蛋白I是VSMC合成表型的功能标记[32]。在一般情况下，细胞骨架蛋白数量是稳定的，肌球蛋白和肌动蛋白表达数量的变化说明VSMC的表型已从收缩型转变为尼古丁暴露后的合成型。

Wang等人研究还发现尼古丁降低了VSMC自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3-α与微管相关蛋白1轻链3-β的比值，提高了P65蛋白的表达与GFP-LC3 puncta的形成，且这种变化是通过尼古丁/nAChRs/ROS/NF-κB通路实现，由此可见尼古丁与VSMC的凋亡密切相关[29]。进一步研究发现，3-甲基腺嘌呤（3-MA，一种可有效阻止自噬的PI3K抑制剂）处理可消除尼古丁诱导的VSMCα-肌动蛋白、平滑肌22α和骨桥蛋白以及胶原蛋白I合成的增加，并抑制细胞迁移，由此可见VSMC凋亡在尼古丁诱导的VSMC表型转化中起到了介导作用[31]。

2.2.2 VSMC迁移与增殖

尼古丁除了可以促进VSMC表型转化，还可以引起VSMC迁移与增殖。Zhu等人发现经尼古丁处理的巨噬细胞胞浆miR-21-3p可被包装成外泌体转移到VSMC中，以剂量依赖性的方式抑制PTEN基因的表达，而实验结果发现PTEN基因抑制有助于VSMC的迁移和扩散[33]。同时划痕实验与迁移实验也表明尼古丁处理显着提高了VSMC的迁移能力[6]。

Xu 等人研究揭示了尼古丁可以通过nAChRα1/STAT3/蛋白激酶 B（Protein Kinase B，PKB）/雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Target of Rapamycin，mTOR）信号通路促进小鼠VSMC的迁移和增殖。尼古丁能够直接作用于VSMC上的nAChRα1，增加VSMC细胞STAT3磷酸化及增强STAT3的核易位，引起更多的p-STAT3与PKB启动子区域的结合，上调MMP-1的表达[34]。MMP-1通过降解斑块内胶原蛋白促进斑块扩张、破裂和出血，为动脉粥样硬化提供了条件[38]。因此，靶向nAChRα1/STAT3可能被认为是减轻尼古丁引起的动脉粥样硬化病变的新治疗策略。另外Ren等人在体外细胞研究中发现尼古丁对小鼠血管平滑肌细胞的作用也可由α1-nAChR诱导的钙蛋白酶-1（Calpain-1）/MMP-2 / MMP-9信号通路介导[35]。MMP-2和MMP-9可通过细胞基质降解和细胞基质相互作用的消除来促进斑块破裂并诱导血管平滑肌细胞凋亡[36]。

2.3 尼古丁与巨噬细胞的转化与迁移

巨噬细胞是动脉粥样硬化病变中最丰富的免疫细胞类型，在疾病的所有阶段（从病变开始到斑块破裂）都具有重要作用。在动脉粥样硬化病变中，巨噬细胞积极参与脂蛋白的摄入和积累，从而形成充满脂滴的泡沫细胞。逐渐积聚的泡沫细胞通过凋亡在内膜中死亡，如果不及时处置，其会坏死并逐渐形成坏死和导致血栓形成[37]。另外巨噬细胞可通过分泌细胞因子进一步加剧了病变发炎，其蛋白水解活性促进了斑块的失稳和破裂，从而导致动脉粥样硬化和相关的缺血事件，例如心肌梗塞或中风[38]。巨噬细胞在动脉粥样硬化的发病机理中发挥的关键作用使它们成为治疗心血管疾病发展的重要靶标。

Ming-Sheng等人研究发现，尼古丁可以增加人外周血CD36+/CD14+单核细胞的比例，且通过激活nAchR/ROS /蛋白激酶C（Protein Kinase C，PKC）/过氧化物酶体增殖物激活受体γ（Peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）信号通路增加了人单核-巨噬细胞CD36的表达[39]。CD36是一种跨膜糖蛋白受体，可结合并内化动脉壁中的ox-LDL，促进巨噬细胞转化为泡沫细胞，在动脉粥样硬化病变的发生中起关键作用[40]。

在一项体外研究中，Ren等人发现尼古丁对小鼠巨噬细胞的作用可由α1nAChR诱导的calpain-1/MMP-2 / MMP-9信号通路介导，并对巨噬细胞的增殖和迁徙起促进作用[41]。过往研究认为，MMPs通过降解细胞外基质促进VSMC向动脉粥样硬化区域迁移，并在该处增殖并增加病变的大小。此外由于在易损动脉粥样硬化斑块中检测到MMPs水平升高，因此认为MMPs可能会降低纤维帽的强度并导致斑块破裂[42]。另外也有研究表明，nAChRα1 负责调节尼古丁诱导的巨噬细胞p-STAT3，p-Akt和p-mTOR活化，而巨噬细胞经mTOR特异性抑制剂雷帕霉素处理后MMP-2表达明显下降，揭示了尼古丁通过nAChRα1/STAT3/Akt/mTOR/MMP-2信号通路加速动脉粥样硬化的可能性[43]。除了α1nAChR，近年来研究发现α7nAChR同样是尼古丁作用于巨噬细胞的重要受体。Liu等人发现尼古丁通过激活巨噬细胞中的ERK1/2/c-Jun途径诱导MMP-9，MMP-2，MCP-1和RANTES 上调，且经α7nAChR 激动剂PNU-282987处理后上述信号转导及因子的表达收到抑制[44]。在一个类似的实验中，Li等人发现尼古丁促进了巨噬细胞MMP-2、MMP-9 和VCAM-1 的表达，且经α7nAChR 激动剂PNU-282987处理后显着抑制了巨噬细胞ERK1/2和c-Jun的磷酸化[45]。两个实验皆表明尼古丁对巨噬细胞的作用可能是通过α7nAChR/ERK1/2/AP-1（c-Jun）通路实现对下游因子表达的控制，未来对此类信号通路的进一步阐明将可能为动脉粥样硬化提供新治疗策略的新型分子靶标。