中药通过调控线粒体自噬保护心肌缺血再灌注损伤的研究进展#

文静 李智 张建武 牛娜△

（1.川北医学院药理教研室，四川 南充，637100；2.川北医学院附属医院药剂科，四川 南充 637100）

缺血性心脏病是全球死亡率最高的疾病之一，目前，利用手术和药物快速有效地恢复冠脉血流是治疗缺血性心血管病的主要方法，在心梗后血运重建、冠脉溶栓、冠脉支架植入术、冠脉搭桥术、心肺复苏及休克后，均有可能出现心肌缺血再灌注损伤（Myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI），进一步诱发心肌功能障碍，临床亟需新的治疗方法和预防手段。

研究显示，缺血再灌注损伤心肌可占全部梗死心肌面积的50%[1]。目前公认的MIRI 有4 种表现形式：再灌注诱发的心律失常、心肌顿抑、微血管阻塞、致死性心肌再灌注损伤，其中前两种表现形式是可逆的，而后两种是不可逆的[2]。因此，目前MIRI 已成为患者从缺血后复流获益的主要障碍，如何预防和减少再灌注损伤是临床上亟待解决的问题。

心血管系统的细胞和组织对能量要求较高，而线粒体是介导能量生成的主要细胞器，线粒体自噬是特异性清除受损线粒体的一种选择性自噬，在维持细胞稳态中发挥重要作用。近年来研究表明，线粒体自噬在缺血性心脏疾病中起着重要作用。中医药在防治心血管疾病方面疗效显著，实验研究也越来越深入，很多中药及复方的作用机制得到阐明。本文就近几年报道可通过调控线粒体自噬途径保护心肌缺血再灌注损伤的中药及复方进行归纳总结，以期为心肌缺血再灌注损伤的临床治疗提供新的研究方向。

1 线粒体自噬

线粒体是介导能量生成、氧化应激和细胞凋亡的主要细胞器，是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷的主要场所，其形态与数量、合成和降解均受到精确的调控。线粒体自噬作为特异性清除受损线粒体的一种选择性自噬，在细胞稳态和各种生理过程中发挥重要作用[3]。线粒体自噬受多种因素的调控，在正常情况下，细胞通过自噬来清除受损或功能障碍的线粒体，但是当线粒体自噬过程受阻或过度自噬时会导致各种疾病的发生和发展[4]。因此线粒体自噬必须保持一定程度上的平衡，自噬不足或过度都可能导致细胞走向死亡，从而加速疾病进程。

线粒体自噬的整个过程可大致分为3 个步骤：①线粒体受到损伤后膜通透性发生改变，膜电位降低导致线粒体去极化，激活线粒体自噬相关蛋白；②自噬体包裹并隔离受损线粒体，形成线粒体自噬体；③线粒体自噬体与溶酶体融合形成线粒体自噬溶酶体，然后在酸性环境下降解内容物[5]。目前已知主要有三条通路可调控线粒体自噬，即 PINK1/Parkin 通路、BNIP3/NIX 通路和FUNDC1 通路[6]。

1.1 PINK1/Parkin 通路

PINK1-Parkin 介导的线粒体自噬是哺乳动物细胞线粒体自噬最常见的方式，也是目前研究最清楚的一条通路[7]。PINK1（PTEN induced putative kinase 1）作为一种广泛存在于细胞质中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在正常生理情况下，PINK1 通过线粒体内膜转运蛋白（Translocator inner membrane，TIM）和线粒体外膜转运蛋白（Translocator outer membrane，TOM）转运至线粒体内膜。在线粒体内膜上，被基质加工肽酶（Matrix processing peptidase，MPP）剪切氨基端线粒体靶向序列。早老素相关菱形蛋白（Presenilin associated rhomboid likeprotein，PARL）剪切PINK1 的氨基酸A103 至F104 跨线粒体内膜的疏水序列，导致在胞质中的PINK1 被泛素蛋白酶体系快速降解[8]。因此PINK1 在细胞内维持低水平。但在MIRI 等病理条件下，ROS 会损伤线粒体，受损的线粒体因缺乏电子传递导致膜电位下降或者未折叠蛋白反应将PINK1 转运至线粒体外膜，从而逃避PARL 的剪切和蛋白降解。PINK1 聚集在功能失调的线粒体外膜上，此时PINK1 会改变泛素分子，改变的泛素随后会招募Parkin 到受损的线粒体上，通过对Parkin 和泛素磷酸化激活Parkin E3 连接酶活性。然后，Parkin 泛素化线粒体外膜融合蛋白1（Mitofusin 1，MFN1）和线粒体外膜融合蛋白2（Mitofusin 2，MFN2）等使线粒体泛素化。随后泛素化的蛋白被自噬受体蛋白OPTN、P62、NDP52 等识别。同时，微管相关蛋白1 轻链3（Microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）和自噬体膜也被募集到受损线粒体周围，与自噬受体结合并吞噬受损的线粒体形成自噬体，随后在溶酶体内降解受损的线粒体。PINK1 和Parkin 位于同一条通路的上下游，协同介导了线粒体的自噬。

1.2 BNIP3/NIX 通路

BNIP3/NIX 与P62 相似，具有LIR 模体，可与LIR 结合作为自噬受体诱导线粒体自噬的发生。目前研究表明BNIP3 和LC3 直接相互作用，介导了线粒体自噬的发生[9]。BNIP3 和NIX 在蛋白序列上具有同源性，但在线粒体自噬过程中BNIP3和NIX 的表现略有不同，在哺乳动物红细胞分化过程中发生的线粒体自噬是由NIX 介导的，而在低氧条件下线粒体和内质网的选择性清除是由BNIP3 介导的。

1.3 FUNDC1 通路

FUNDC1 是仅位于线粒体外膜的蛋白，在正常情况下，FUNDC1 能被蛋白激酶Src 磷酸化，而磷酸化的FUNDC1 和LC3 的相互作用比较弱，FUNDC1 的功能受到抑制，因此FUNDC1 能稳定存在于线粒体外膜而不介导线粒体自噬的发生。在低氧的情况下，蛋白激酶Src 的活性降低，导致FUNDC1 磷酸化水平的降低，从而促进其与LC3 相互作用和线粒体自噬的发生。FUNDC1 的18 位酪氨酸磷酸化是线粒体自噬的分子开关。

2 中医理论下心肌缺血与线粒体自噬

中医理论认为，心主血脉，血脉瘀阻则会出现胸痹、心悸等症状，故缺血性心脏病在中医常归属于“胸痹、心痛、真心痛、厥心痛”等范畴。其病症最早记载于《黄帝内经》：“脉虚则血虚，血虚则痛”，初有心痛之描述，至东汉时期，张仲景在《金匮要略》中正式提出胸痹概念：“阳微阴弦，即胸痹而痛”。其病机主要为本虚标实，虚实夹杂，标实以血瘀、痰湿、气滞、寒凝为主，本虚主要是气虚、阴虚。据此，中医针对冠心病的治则主要有活血化瘀法、宣痹通阳法、芳香温通法、调整脾胃法、益气养阴法、补肾固本法等。

中医理论认为“气”是组成人体和维持人体基本生命活动的本元，有学者对中医“气”和西医“线粒体”在来源、形态、功能、临床表现、预防治疗等方面的相关性进行了研究，认为中医“气”与西医“线粒体”的作用非常相似。线粒体可产生能量证实气化功能的体现，线粒体自噬的过程是清除受损的线粒体以维持细胞的稳态，这与中医的益气活血法相符合。线粒体自噬所发挥的作用即是中医益气活血法的微观体现。故推测，中医药治疗缺血性心脏病的主要作用靶点与线粒体密切相关[10，11]。

3 中药参与调节线粒体自噬保护心肌缺血的相关机制

线粒体自噬的程度对心肌细胞保护起到双向作用。具体表现为，正常情况下，心肌细胞自噬维持在一定的水平，这种基础水平自噬是一种分解代谢平衡途径，对减少心肌细胞死亡，维持心脏功能具有重要作用。而在心肌缺血阶段，自噬降解非功能性胞质蛋白，为关键生命活动提供关键营养，从而抑制细胞凋亡和坏死。因此，心肌缺血时自噬水平提高，可分解受损细胞器或异常蛋白质为心肌代谢提供能量，维持心肌收缩力。若自噬下调，大量有害物质则会在细胞内积聚，导致细胞受损及死亡，加重疾病的发展。

随着现代生物学研究的深入，越来越多的中药及复方被证实可以通过调控不同的信号通路来调节线粒体自噬从而改善缺血/再灌注后的心肌细胞损伤。

3.1 调控PINK1/Parkin 通路

PINK1/Parkin 信号通路是线粒体自噬中最常见的通路，也是研究最清楚的一条通路，研究发现，很多中药及复方可以通过调控该通路来调节线粒体自噬，最终改善心肌细胞损伤。

刘超等研究发现，丹皮酚可通过激活PINK1/Parkin 信号通路促进线粒体自噬，进而减轻心肌细胞损伤，改善大鼠心脏功能和心室重构情况[12]。李旭阳等研究了黄芪甲苷对缺血再灌注诱导的大鼠心肌细胞及线粒体自噬的调节作用机制，结果显示黄芪甲苷可通过降低PINK1、Parkin、p62、L3Ⅱ的表达，调控PINK1/Parkin 通路[13]。有实验研究显示，梓醇干预可上调缺氧缺糖H9c2心肌细胞Beclin1、LC3 和Parkin 表达，下调P62、PINK1 表达，并出现明显的自噬小体，小体中包裹着破损的线粒体[14]。提示梓醇可通过上调PINK1/Parkin 通路，激活线粒体自噬来减轻心肌缺血损伤。丹参酮ⅡA 是丹参的主要活性成分之一，王佳楠等通过研究发现丹参酮ⅡA 能降低心肌缺血大鼠心肌线粒体中Beclin1 的表达和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，能促进P62 蛋白的表达，同时大鼠心肌损伤情况得到明显改善，推测丹参酮ⅡA 可通过抑制线粒体过度自噬来达到保护心肌的目的[15]。荭草苷对心肌缺血/再灌注损伤大鼠心肌细胞内线粒体具有明显保护作用，其机制可能与通过Parkin 依赖性和Parkin 非依赖性信号通路抑制心肌细胞内线粒体自噬过度激活有关[16]。黄连素是中药黄连的主要活性成分，临床常用于治疗痢疾杆菌和大肠杆菌引起的肠道感染，近几年的研究发现黄连素对缺血性心脏病也有独特的调控作用。有研究显示黄连素预处理可上调缺氧4h、复氧3h H9c2 心肌细胞PINK1、Parkin 蛋白含量，激活PINK1/Parkin 通路，促进线粒体自噬，减轻MIRI[17]。五味子总木脂素是五味子的活性成分之一，有研究显示五味子总木脂素可使衰老模型小鼠脑组织中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达水平降低。体外实验也表明五味子总木脂素干预后小鼠大脑皮质和海马神经元中LC3 蛋白阳性细胞数减少，其作用机制与五味子总木脂素调节自噬作用有关[18]。

栝楼薤白半夏汤出自汉代张仲景所著的《金匮要略》，由栝蒌实、薤白、半夏等组成，具有行气解郁，通阳散结，祛痰宽胸的功效，现代临床常用于治疗冠心病心绞痛等疾病的治疗。动物实验研究显示，栝楼薤白半夏汤能显著降低MIRI 大鼠血清CK-MB、LDH 含量，下调大鼠心肌Beclin-1、P62、PINK1、Parkin 蛋白表达，上调Mfn2 蛋白表达，提示栝楼薤白半夏汤可通过抑制Pink1/Parkin 信号通路，减轻线粒体自噬而发挥心肌保护作用[19]。

通心络是根据络病理论所创立的复方中药，由人参、水蛭、全蝎、赤芍、蝉蜕、土鳖虫、蜈蚣、檀香、降香、乳香（制）、酸枣仁（炒）、冰片组成。该方具有益气活血、通络止痛的功效，临床主要用于冠心病心绞痛属心气虚乏、血瘀络阻证的治疗。实验研究显示，通心络缓解心肌缺血再灌注损伤和调控心肌细胞自噬水平密切相关，通心络可通过PINK1/Parkin 线粒体自噬通路清除损伤线粒体，并和泛素蛋白酶系统协同处理错误折叠蛋白的降解，维持细胞内平衡，保护心肌细胞[20]。

益气活血方为临床经验用方，由生黄芪、人参、当归、川芎、三七组成。陈曦通过实验研究发现，心肌梗死后，自噬蛋白与基因表达于7 天时增加，28 天时减少，运用益气活血方可以于7 天、28 天动态调节心肌细胞自噬蛋白与基因表达，于7 天时抑制LC3A、LC3B、Beclin1 蛋白表达，于28 天时促进LC3A、LC3B、Beclin1 蛋白表达[21]。

加味丹参饮以补气活血为法，由丹参、黄芪、赤芍、檀香、红花、当归、川芎等药组成。实验证实，加味丹参饮能上调缺氧/复氧大鼠心肌细胞中自噬相关蛋白LC3-Ⅱ及Beclin-1 的表达，增强细胞自噬，保护损伤的心肌细胞[22]。

痰瘀同治方由瓜蒌、薤白、清半夏、柴胡、赤芍、川芎、黄连、甘草等组成。动物实验表明，痰瘀同治方能抑制心肌缺血再灌注模型大鼠缺血期Beclin-1 mRNA 的表达以及再灌注期Beclin-1、LC3 mRNA 的表达，表明痰瘀同治方可通过促进缺血期自噬发生及抑制再灌注期自噬的过表达而发挥对心肌缺血再灌注损伤心肌的保护作用[23]。

3.2 调控BNIP3/NIX 通路

丹酚酸B 是丹参中的一种酚类化合物，辛高杰采用H9c2 细胞探讨丹酚酸B 保护缺氧/复氧损伤的机制是否与调控NIX 介导的线粒体自噬有关，实验结果显示，丹酚酸B 能降低自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，下调NIX 蛋白的表达，提示丹酚酸B 对H9c2 心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用与抑制线粒体自噬发生有关，其具体机制可能为抑制NIX 介导的线粒体自噬激活，从而升高线粒体膜电位[24]。

有研究者采用H9c2 细胞缺氧4h 复氧3h 以及大鼠缺血30min、再灌注120min 两种模型探讨黄连素对MIRI 的作用，结果体内外实验均表明，黄连素预处理会增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、BNIP3和NIX 含量，可通过激活BNIP3/NIX 通路介导的线粒体自噬减轻心肌细胞及模型大鼠的缺血/再灌注损伤[25]。但也有研究显示[26，27]黄连素预处理可通过降低ROS 水平以及抑制BNIP3/NIX 信号通路抑制过度自噬，提示黄连素对线粒体自噬具有双重调控作用。

3.3 调控FUNDC1 通路

双参宁心胶囊的主要成分为人参总皂苷，丹参总酚酸，元胡总生物碱[28]。该药具有益气行血，化瘀止痛之功效，临床用以治理气虚血瘀证的“胸痹”、“心痛”。实验研究证实，双参宁心胶囊对大鼠心肌缺血后再灌注阶段心肌细胞内线粒体自噬存在抑制作用，进一步研究发现该抑制作用可能与抑制FUNDC1 介导的线粒体自噬激活有关，而对BNIP3、NIX 介导的线粒体自噬未发现调控作用[29]。

3.4 调控AMPK-mTOR 通路

五味子具有收敛固涩，益气生津，补肾宁心的作用。有研究发现，五味子乙素可显著降低MIRI 模型小鼠心肌损伤指标，其机制可能与升高线粒体自噬标记蛋白环氧化酶Ⅰ的mRNA 水平、促进 Beclin1 蛋白表达水平以及激活AMPK/mTOR/ULK1 信号通路有关[30]。

血府逐瘀汤是著名活血化瘀方剂，临床用于治疗多种心血管疾病。细胞实验证实血府逐瘀汤对缺氧/复氧H9c2 细胞具有保护作用，机制研究结果显示血府逐瘀汤可降低LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、下调Beclin-1 蛋白表达、抑制AMPK 活化、上调mTOR 磷酸化作用，提示血府逐瘀汤可通过调控AMPK-mTOR 信号通路抑制自噬保护缺氧/复氧心肌细胞[31]。

体外缺氧/复氧细胞实验证实痰瘀同治方可通过调控AMPK-mTOR 通路、抑制自噬而起到心肌保护作用[32]。

3.5 调控PI3K-Akt-mTOR 通路

人参皂苷是一类固醇类化合物，主要存在于人参属药材中，也是人参的主要活性成分。实验研究显示，人参皂苷Rg1 能降低缺血再灌注模型大鼠LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin1 表达水平，升高P62 表达水平，通过激活PI3K-Akt-mTOR 信号通路抑制过度的线粒体自噬，保护心肌细胞缺氧损伤及体内大鼠心肌缺血/再灌注损伤[33]。

4 小结与展望

综上所述，线粒体自噬与心肌缺血再灌注损伤关系密切，主要体现在两个方面，一方面，早期适度的自噬可以清除受损线粒体从而保护心肌细胞；另一方面，晚期过度自噬会吞噬正常线粒体进一步损伤心肌。

中药具有多成分、多靶点的特点，可同时对多条信号通路产生影响，实验研究也证实，很多中药、复方或提取物对线粒体自噬具有双重调控作用，当自噬不足时可激活线粒体自噬途径，当自噬过度时，可抑制线粒体过度自噬。其机制主要与调控PINK1/Parkin 通路、BNIP3/NIX 通路、FUNDC1 通路、AMPK-mTOR 通路、PI3K-Akt-mTOR 通路等信号通路有关。但目前的研究对药物和化合物种类覆盖还不够全面，单味药提取物的研究主要局限于黄酮类、皂苷类以及酚类成分，对其它成分的研究较少；中药复方的研究主要局限于具有补气、活血、化瘀、行气、通络功效的复方。今后应在中医药理论之下，加强中药及复方的基础实验研究，进一步阐明中医药对心肌缺血再灌注损伤的保护作用机制，为临床心肌缺血再灌注损伤的治疗提供更多的参考价值。