香烟烟雾所致肺动脉高压大鼠模型的肺小血管肌化程度及意义

孙得胜，刘虹延，刘先胜，欧阳瑶，徐永健

肺动脉高压是临床上比较常见、但是未受到重视的一类肺血管疾病，其特征是各种原因导致肺血管阻力异常增加，进而发生持续和显著的肺动脉压力升高、右心室功能障碍，最终导致失代偿性心力衰竭，甚至死亡［1-2］。作为一种常危及生命的疾病，肺动脉高压可以作为一类独立的疾病，也可以作为多种常见疾病〔如慢性阻塞性肺疾病（简称慢阻肺）、慢性血栓栓塞、结缔组织疾病等〕发生、发展的关键病理环节，以及增加上述疾病发病率和降低患者生存率的独立危险因素，严重影响患者的生存质量及预后。近年来，虽然在肺动脉高压基因和分子生物学方面的研究取得较大进展，但目前高发病率、高死亡率的现状并无明显改善。因此，积极探索其病理机制，进一步寻找有效的干预靶点具有重要临床意义。

一项慢阻肺合并肺动脉高压的小鼠模型实验显示，模型组小鼠的肺血管重塑与其肺小血管的肌化有关，随着肺小血管肌化程度加重，模型组小鼠肺血管重塑程度加重，其血流动力学指标也随之改变［3］。

以往认为，慢阻肺患者或者长期吸烟患者发生肺动脉高压是因为患者患病过程中发生了缺氧，因为慢性缺氧刺激而引起肺血管收缩、红细胞增多进而导致血液黏稠、肺小动脉重构，从而引发肺动脉高压，因此部分学者认为此情况下肺动脉高压的发生是继发或伴发于慢阻肺［4］。但是有研究发现，部分慢阻肺患者中的吸烟人群在疾病的早期、甚至在肺功能正常且未发生明显缺氧表现时已发生肺小血管重塑，香烟烟雾可直接作用于肺血管系统，导致肺动脉高压［5-7］，但是具体机制尚不清楚，在这种单纯的香烟烟雾的作用下是否伴有肺小血管肌化尚待研究。

本实验拟研究在单纯香烟烟雾刺激的情况下，能否有效构建肺动脉高压动物模型，从而为研究肺动脉高压的发病机制构建平台，同时观察在肺动脉重塑的发生、发展的过程中，肺小血管肌化在其中扮演的角色，为进一步深入探讨香烟烟雾在这一发病过程中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 2018年1—5月在华中科技大学同济医学院实验动物中心进行实验。选取清洁级雄性SD大鼠16只，体质量200 g左右，购于湖北省实验动物中心〔SCXK（鄂）2015-0018〕。香烟烟雾暴露动物染毒系统（本课题组自主研发，专利号ZL201820234399.3），Olympus光学显微镜（奥林巴斯有限公司），通用型免疫组化试剂盒（上海基因科技公司），小鼠抗大鼠α-SMA单克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司），香烟（红金龙牌，烟气烟碱量0.6 mg、焦油含量9 mg、烟气一氧化碳量11 mg，湖北中烟工业有限责任公司）。

1.2 造模方法 采用随机数字表法将大鼠分为对照组和模型组，各8只。模型组大鼠在自制烟雾染毒箱［8］内接受香烟烟雾暴露，2次/d，燃香烟12支/次，连续造模4个月，箱内氧浓度波动于18%～21%，造模时箱内一氧化碳浓度为900 mg/L。对照组不予香烟烟雾刺激。模型组右心室收缩压和平均右心室压高于对照组可判定造模成功。

1.3 血流动力学指标检测 造模满4个月时，观察大鼠活动、饮食、毛发等一般状况并检测右心室收缩压和平均右心室压。两组大鼠逐只称重量后，以2%戊巴比妥钠麻醉大鼠，迅速进行气管插管、连接小动物呼吸机辅助通气，并调节合适的吸呼比、潮气量等。参考国内外多个研究团队的经验［9-12］，予右心导管法检测血流动力学，具体如下：切开大鼠的颈部皮肤，分离大鼠颈静脉，结扎静脉远端，在静脉的近心端剪一楔形口，随之顺势将内置有导丝的测量管插入，并轻轻地向前推进，后经锁骨下静脉进入右心房，然后缓慢进入右心室，此时可见导管内有血液回流，立即退出导丝，将导管末端连接探测仪，观察波形并调整导管方向，待波形典型并稳定后记录，最后以PowerLab 软件分析右心室收缩压和平均右心室压。

1.4 评估右心室肥厚程度 检测血流动力学指标后，取大鼠的肺叶组织予以4%多聚甲醛固定。剪破大鼠的右心耳，将心室里的血液用0.9%氯化钠溶液冲洗干净。剥离右心室室壁，心脏分离为右心室、左心室+室间隔两部分，将各组织在干净滤纸上滤去多余的水分，然后分别称量。计算右心室肥厚指数、右心室重量和体质量的比值（RV/BW）。

1.5 肺血管肌化程度 将固定好的大鼠肺组织用石蜡包埋并制作切片，采用免疫组织化学法检测肺小血管中α-SMA的表达，以评估肺血管肌化程度。α-SMA阳性表达长度＜血管周长的25%，记作未肌化；阳性表达长度＞血管总周长的75%，记作完全肌化；介于两者之间的记为部分肌化。测量、计算两组大鼠肺小血管总的肌化水平并分类计算两组大鼠肺小血管完全肌化、部分肌化以及未肌化比例，并比较两组间的差异。

1.6 统计学方法 采用GraphPad Prism 8.0软件分析数据。计量资料以（x± s）表示，两组间比较采用成组t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠的一般情况 造模4个月后，对照组大鼠活动、饮食、毛发等一般状况未见异常，而模型组大鼠明显表现出倦怠状态，常蜷缩于角落，不积极寻觅食物，毛发也变得比较枯黄。模型组大鼠右心室收缩压和平均右心室压高于对照组，体质量低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

2.2 两组大鼠右心室肥厚程度比较 模型组右心室肥厚指数和RV/BW高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表 2）。

2.3 两组大鼠肺小血管肌化比例比较 肺动脉高压模型组大鼠的肺血管中α-SMA的表达水平强于对照组（见图1）。对照组大鼠的肺小血管肌化比例低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组肺小血管中未肌化比例低于对照组，部分肌化和完全肌化比例高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表3）。

3 讨论

吸烟早已成为当今社会中一个严重影响健康的问题。大量科学证据表明，吸烟可导致多部位恶性肿瘤、多种慢性疾病、生殖与发育异常，还与其他很多疾病及健康问题的发生密切相关［13-15］。对于吸烟对健康影响的研究，目前常通过建立整体动物烟雾染毒模型来完成，如何成功建立模拟人类吸烟的动物模型是关键环节。因此，建立一种将香烟烟雾给实验对象染毒的装置是非常必要的，本课题组自主研发了香烟烟雾暴露动物染毒系统（专利号：ZL201820234399.3），为本研究的顺利开展创造了有利条件。在科学研究的过程中，研究某一种致病因素对某一疾病的影响，需要尽可能地排除或避免其他容易导致该病的常见危险因素的混淆和干扰。市面上常见的小动物熏烟箱一般无法监测箱内的氧气浓度和烟雾浓度，而本课题组研制的动物染毒系统在设计上兼顾了上述因素，一方面通过设置和调节恒定的烟雾浓度保障了造模条件的稳定性，另一方面通过氧浓度的监测避免了环境缺氧对研究结果的干扰。

表1 两组右心室压力和体质量比较（±s）Table 1 Comparison of the mean right ventricular pressure and body weight of two groups of rats at the completion of modeling

表1 两组右心室压力和体质量比较（±s）Table 1 Comparison of the mean right ventricular pressure and body weight of two groups of rats at the completion of modeling

体质量（g）对照组 8 2 1±4 1 3±2 4 9 3.8±1 5.0模型组 8 4 2±8 2 3±5 4 0 1.3±4.9 t值 6.9 9 5.3 7 5.8 7 P值 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1组别 只数 右心室收缩压（m m H g）平均右心室压（m m H g）

表2 两组大鼠右心室肥厚程度比较（±s）Table 2 Comparison of right ventricular hypertrophy between two groups of rats

表2 两组大鼠右心室肥厚程度比较（±s）Table 2 Comparison of right ventricular hypertrophy between two groups of rats

注：RV/BW=右心室质量和体质量的比值

组别 只数 右心室肥厚指数 RV/BW对照组 8 0.21±0.01 0.39±0.08模型组 8 0.34±0.03 0.64±0.10 t值 10.96 5.13 P值 ＜0.001 ＜0.001

图1 大鼠小血管肌化水平（免疫组化，×100倍）Figure 1 Level of muscularization of pulmonary arterioles in rats of control group versus those of the model group

表3 对照组和吸烟组大鼠小血管肌化水平的比较（±s，%）Table 3 Comparison of the level of muscularization of pulmonary arterioles between two groups of rats

表3 对照组和吸烟组大鼠小血管肌化水平的比较（±s，%）Table 3 Comparison of the level of muscularization of pulmonary arterioles between two groups of rats

完全肌化比例对照组 8 2 1.3 3±4.0 4 8 2.0 0±2.1 6 1 0.6 7±2.0 4 1 0.6 7±1.9 7模型组 8 4 1.3 3±1.5 3 5 4.0 0±3.0 4 1 7.0 0±2.2 5 2 5.6 7±3.3 8 t值 8.0 2 8.7 6 1.9 8 4.6 9 P值 ＜0.0 1 ＜0.0 1 ＜0.0 5 ＜0.0 1组别 只数 总肌化比例 未肌化比例 部分肌化比例

香烟烟雾能否作为独立危险因素直接引起肺动脉高压，仍存在争议，甚至世界卫生组织的肺动脉高压会议给出的肺动脉高压分类说明也没有确认吸烟是肺动脉高压的致病因素［16］。但是，部分吸烟的肺动脉高压患者并没有伴发慢阻肺。而关于香烟烟雾引起的慢阻肺的研究发现，肺循环的改变发生在该疾病的初期，而缺氧在该疾病的早期并不存在，从而表明香烟烟雾刺激可能直接引起肺动脉高压［5，17］。因而，探讨单纯的香烟烟雾的造模刺激是否能诱导出肺动脉高压的疾病模型、并进一步探究其机制，具有重要的理论和现实意义。

本研究结果显示，模型组大鼠右心室收缩压和平均右心室压高于对照组。众所周知，右心室收缩压和平均右心室压在动物实验研究中常用来代表受试动物的肺动脉收缩压及平均肺动脉压，所以上述结果提示本研究肺动脉高压动物模型构建成功。

因为缺氧是引起肺动脉高压的常见危险因素，本研究为了排除环境缺氧对实验结果的干扰，实时监测了造模期间香烟烟雾暴露动物染毒系统中氧气的浓度。另外，本课题组前期研究采集各组大鼠的腹主动脉动脉血1 ml行动脉血气分析，各组间大鼠的动脉血氧分压无差异（P＞0.05）［18］，从而确保本研究造模过程中肺动脉高压的发生是在单纯的香烟烟雾的刺激下形成的，进一步避免了缺氧因素在本研究中的混杂作用。

右心室肥厚指数和RV/BW是常用的检测右心室肥厚程度的指标，本研究结果显示，模型组右心室肥厚指数和RV/BW高于对照组，提示随着患鼠肺动脉高压的发生、发展，其右心室肥厚程度比对照组明显加重，这也符合临床上肺动脉高压患者的右心室病理改变的特点。

本研究还发现，模型组大鼠的肺小血管中α-SMA的表达水平强于对照组，提示在香烟烟雾的长期刺激下，大鼠的肺小血管的肌化程度明显加重，本研究结果与国外的一项关于慢阻肺合并肺动脉高压的小鼠模型研究得到的结论一致［3］。对照组大鼠的肺小血管肌化比例低于模型组，模型组肺小血管中未肌化比例低于对照组，部分肌化和完全肌化比例高于对照组，结果显示肺动脉高压模型组的未肌化肺小血管明显减少，而完全肌化了的肺小血管和部分肌化了的肺小血管的比例明显升高。

肺小血管的肌化改变是肺血管重塑比较常见的表现形式，而肺血管重塑是肺动脉高压发病环节中除了肺血管收缩以外最重要的病理特征之一，被认为是肺动脉高压发生、发展的重要病理基础［19］。本研究发现，在香烟烟雾刺激诱导的肺动脉高压大鼠模型中，单纯香烟烟雾刺激可直接导致肺动脉高压的发生，香烟烟雾可作为肺动脉高压致病的独立危险因素，进一步研究发现，肺动脉高压患鼠的肺小血管的肌化程度，比健康对照组明显加重，提示着其发病可能与肺小血管的肌化程度加重有关。

综上所述，单纯香烟烟雾刺激可直接诱发肺动脉高压，其发病机制可能与肺小动脉都的肌化程度加重有关。

作者贡献：孙得胜进行研究设计与实施、资料收集整理、撰写论文并对文章负责；刘虹延、刘先胜、欧阳瑶进行研究实施、评估、资料收集；孙得胜、徐永健进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。