黄酮类混合物的碱金属加合离子电喷雾质谱研究1

张 娜，崔 朋，刘 伟

（1.黄山学院 化学化工学院；2.黄山学院 现代教育技术中心，安徽 黄山 245041）

在天然产物的研究中，应用质谱技术鉴定未知的活性物质具有特别重要的意义.然而，利用现有的分析技术和方法对这些化合物进行结构鉴定仍然是一个挑战.这是由于天然产物中有较多异构体的存在，且有些物质具有高丰度的碎片离子峰，而分子离子峰的丰度较低、信息贫乏，从而导致未知化合物识别过程中具有不可避免的模糊性.

为了克服上述缺点，学者们做出了不同的探讨.Hadavi Darya［1］以加合离子的形成作为研究10 种异构体分子结构的工具，结果表明飞行时间（TOF）对钠和锂加合物具有最高的分辨率，同时加合离子的形成有助于结构异构体甚至立体异构体在分离时产生不同的分子构象，因此评估加合物和不同构象结构是物质分离鉴定时很有价值的策略.Younes Valadbeigi［2］、Tamar Shamai Yamin［3］也利用质谱中伴随的金属离子加合物使结构解析更加可靠.赵凡智课题组［4］研究发现，在糖苷混合物中引入碱金属离子后，混合物FAB 正离子谱中仅出现加合离子峰而难于找到碎片的加合离子峰，且由于两种碱金属离子Na+和Li+原子量之差为16，质谱图中会出现两个一组的多组强峰，且每组的两峰质量差为16，其中低质量峰为［M+Li］+峰，高质量峰为［M+Na］+峰，以此可以判断各成分的精确质量数，同时谱图中出现的强峰组数就是糖苷混合物的成分数.周剑［5］、荀合［6］等人也得出了类似的结论.

在众多的研究中，碱金属离子主要采用Li，Na，K和Cs；基体为巯基尿酸共轭物［1］、胞嘧啶［2］、哌醋酯衍生物［3］、糖苷混合物［4］、疏螺旋体素［5］、丙烯醛脱氧鸟苷［7］、甜菜碱等生物样品［8］、苯分子［9］、木质素［10］、聚己二酸丁二醇酯［11］、聚乙二醇［12］等；广泛采用的离子源为FAB 及ESI 离子源［4-14］；以ESI 为离子源，黄酮和黄酮苷为基体，采用UPLC-QTOF-MS技术研究黄酮类碱金属加合物则未见报道.

本文利用UPLC-QTOF-MS 技术，采用ESI 离子源，在正离子模式下采集数据，研究了7种黄酮类混合物（基体B）与碱金属离子混合物M+（M=Li、Na 和K）的加合质谱，探讨了基体B 与M+在不同碰撞能、不同浓度、不同加入方式下碱金属加合离子的形成以及不同加合离子的相对丰度，以期为天然产物中未知物质的分离鉴定提供理论依据.

1 试剂与仪器

主要试剂有表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、芹菜素-7-o-β-D-吡喃葡萄糖苷、异鼠李素、烟花苷、芒果苷、野漆树苷、甲醇、乙腈、无水乙醇，均为HPLC或更高级别；氯化锂、氯化钠、氯化钾为优级纯.

主要仪器有超高效液相串联飞行时间质谱联用仪（waters）、超纯水机（Milli-Q）等.

2 实验条件

2.1 UPLC色谱条件

CORTECS UPLC C18 色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）；纯水A-乙腈B 流动相；梯度洗脱程序为0～1 min（90%A，10%B），1～15 min（90%A～10%A，10%B～90% B），15～17 min（10% A～70% A，90% B～30% B），17～17.5 min（70% A～90% A，30% B～10% B），17.5～20 min（90% A，10% B）；柱温为40.0℃；流速0.300 mL/min；进样量为1 μL.

2.2 Q-TOF/MS质谱条件

使用电喷雾离子源进行正离子扫描（ESI+）；扫描范围m/z 100～1500；扫描时间0～20 min；锥孔电压40 V；毛细管电压3 kV；使用900 L/h 氮气为除溶剂气体；除溶剂温度为500 ℃；碰撞能量分别采用6 eV 和10～20 eV.

2.3 实验步骤

黄酮类基体B 混标与单标均为10μg/mL 甲醇溶液；碱金属离子M+混合溶液为0.1 mol/L 水溶液，使用时逐级稀释.

不同碰撞能：6 eV（模式一，低能量）和10～20 eV（模式二，高能量）；

不同浓度M+：浓度分别为0、5×10-3mol/L、5×10-2mol/L；

M+不同加入方式：流动相中加入M+直接扫描；基体B中加入M+，放置1 h后扫描.

3 实验结果与讨论

3.1 总离子流图

图1 总离子流图（ESI+，碰撞能10～20eV，M+=5×10-3mol/L）

由图1可见7种化合物实现分离，根据质谱图中的准分子离子峰，可确定峰1～7 分别为表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、芒果苷、芹菜素-7-o-β-D-吡喃葡萄糖苷、野漆树苷、烟花苷、异鼠李素.

3.2 不同碰撞能时化合物的质谱图

以野漆树苷为例（精确质量数为578.1626），对比模式一和模式二（碰撞能量分别为6 eV 和10～20 eV）下的质谱图，观察不同碱金属加合离子的丰度.由图2可见，不同碰撞能下，m/z 579［M+H］+丰度均为最大，m/z 585［M+Li］+丰度极小，碰撞能增大时，m/z 601［M+Na］+、m/z 617［M+K］+丰度明显升高，更适合于观察碱金属加合物.同时，各加合物［B+M］+成组出现，质量数之差为16，可直接确定待测物的精确质量数.下文以高能量时质谱图为例，进行丰度对比.

图2 不同碰撞能下野漆树苷的质谱图

3.3 不同浓度M+时化合物的质谱图

以野漆树苷为例，对比不同浓度M+时化合物的质谱图（M+=0、5×10-3mol/L、5×10-2mol/L），观察不同碱金属加合离子的丰度（见图3），结果显示随着M+离子浓度的增加，m/z 601［M+Na］+、m/z 617［M+K］+丰度都有所升高，显示加合物的丰度与M+浓度有关.同时高碰撞能下m/z 579［M+H］+、m/z 585［M+Li］+丰度极小，推测［B+M］+的丰度不仅与底物的结构和金属离子浓度有关，还与金属离子的直径大小有关.同时，加合物［B+M］+仍然成组出现.

图3 不同浓度M+时野漆树苷的质谱图

3.4 不同加入方式时的质谱图

以野漆树苷为例，对比不同加入方式时化合物的质谱图（加入基体B中放置1h、加入流动相），观察不同碱金属加合离子的丰度（见图4），结果显示直接加入流动相时，加合物的丰度相对较高，加合物［B+M］+也成组出现.

图4 不同加入方式时野漆树苷的质谱图

3.5 不同实验条件下，碱金属加合离子的丰度对比

以相同的方法研究了除野漆树苷外的其他6种黄酮类化合物，探讨了不同碰撞能（6 eV、10～20 eV）；不同浓度M+（0、5×10-3mol/L、5×10-2mol/L）；M+不同加入方式（加入流动相中、加入基体B 中并放置1h）条件下，加合物［B+M］+的丰度变化，结果显示，表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、芹菜素-7-o-β-D-吡喃葡萄糖苷、异鼠李素、烟花苷、芒果苷6 种黄酮类化合物与野漆树苷具有相同的规律，不同条件下各加合物［B+M］+的丰度见表1-3.

由表1 可见，随着碰撞能的增加，［M+H］+的相对强度通常会减弱，加合物［B+M］+的相对强度有所增强；异鼠李素在不同碰撞能条件下，［M+H］+的相对丰度均为最高，从结构上看，与文中其他6种黄酮类物质相比，其结构中含有的羟基最少，推测是由于羟基最少且不含糖苷，因此相对来说难以形成［B+M］+加合物.

表1 不同碰撞能时，加合物［B+M］+的相对强度（M+=5×10-2mol/L）

（续表1）

由表2 可见，随着M+浓度的增加，［M+Li］+、［M+K］+的相对强度逐渐增强；［M+H］+、［M+Na］+的相对强度则无此规律，这或许是由于受环境或流动相中H+、Na+影响的缘故.

表2 不同浓度M+时，加合物［B+M］+的相对强度（M+=0、5×10-3mol/L、5×10-2mol/L，10～20eV）

由表3 可见，通常情况下，将M+加入流动相中，可以获得更高的［B+M］+丰度.同时可以看出，低碰撞能和低的M+浓度下，［M+H］+相对丰度通常较高，这对加合物［B+M］+的研究是不利的，提示在进行［B+M］+研究时应采用高碰撞能和高的M+浓度.

表3 不同加入方式时，加合物［B+M］+的相对强度（加入基体B中放置1h、加入流动相中，M+=5×10-3mol/L，6eV）

4 结论

如上所述，在基体中加入适量的碱金属离子形成加合离子可以作为确定未知物精确质量数和结构鉴定的常用方法.研究结果显示：在流动相中加入高浓度的M+离子，采用高的碰撞能扫描模式，可以在质谱中看到更多的、丰度更高的碱金属加合离子.由于碱金属加合离子之间的差值均为16，同一物质能观察到几对加合离子峰，故可以较容易的判断出准分子离子，从而为复杂混合物的分析鉴定提供参考.需要注意的是，不同化合物加合离子的形成具有选择性，对Li+、Na+和K+表现出不同的加合能力，这仍需要进行深入的研究.