基于网络药理学探讨防风-辛夷药对治疗变应性鼻炎的作用机制

李宇思 谢慧 刘艳 李清韵 肖旭

变应性鼻炎(Allergic Rhinitis,AR)，俗称过敏性鼻炎，患病率为10%～25%，是由于机体针对变应原产生过量的特异性IgE而诱发，导致鼻腔黏膜水肿、喷嚏、鼻痒、分泌物增多等一系列症状。变应性鼻炎属祖国医学“鼻鼽”的范畴，目前临床尚无特效药治疗，西医主要使用抗组胺药、糖皮质激素等治疗[1]。中药在预防和治疗变应性鼻炎中具有很大的优势和潜力。

防风、辛夷是导师谢慧治疗变应性鼻炎的常用药对，长期的临床观察发现该药对的应用能缓解变应性鼻炎鼻塞、鼻痒、喷嚏、流清涕的症状，并能减少其发作。刘金垒等通过对治疗变应性鼻炎国家专利中药复方的挖掘发现，治疗变应性鼻炎最多的对药为防风-辛夷[2]。防风辛、甘，温，归膀胱、肝、脾经，功擅解表祛风，胜湿，止痉。辛夷辛，温，归肺、胃经，功擅散风寒，通鼻窍。变应性鼻炎的主要病机是肺气虚弱，风寒外袭[2]，防风、辛夷合用，可增强祛风散寒通鼻窍之用，但两药配伍治疗变应性鼻炎的药效机制尚不明了，有待进一步阐明，本文运用网络药理学，对防风-辛夷药对治疗变应性鼻炎的活性成分、关键靶点、作用机制等进行初步探索，为后续研究提供依据与思路。

1 材料与方法

1.1药效成分收集筛选

以防风、辛夷为研究对象，通过中药系统药理数据库和分析平台(TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)进行化学成分的查询及筛选[3]。选取口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%且类药性(drug-likeness，DL)≥0.18[4]的化学成分作为潜在有效成分。

1.2药效成分靶点预测

继续通过TCMSP数据库检索防风和辛夷的所有成分的靶点，并与已得到的潜在成分相映射，获得潜在靶点，利用 Drugbank数据库(https://www.drugbank.ca/)和Uniprot 数据库(http：//www.uniprot.org/)将防风和辛夷有效靶点与人类相关基因相对应，获得药物的潜在靶点。

1.3疾病靶点预测

通过GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、OMIM数据库(http：//www.omim.org/)、Drugbank数据库(https：//www.drugbank.ca/)搜索“allergic rhinitis”，合并3个疾病数据库的靶点，删除重复值作为疾病候选靶点。在Unitprot数据库中查询靶点的基因名，对候选靶点进行标准化处理。

1.4构建“药物-活性成分-靶点”网络

将药物疾病映射的共同靶点与药物的有效活性成分导入 Cytoscape 3.8.0软件，构建药物-活性成分-靶点网络图。

1.5获取药物与疾病的共同靶点

借助Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)将药物潜在靶点与疾病作用靶点取交集，获得防风-辛夷药对治疗变应性鼻炎的关键靶点，绘制韦恩图。

1.6构建关键靶点蛋白相互作用(protein-protein interaction, PPI)网络

为了进一步获取关键靶点，利用 STRING 数据库(https://string-db.org/)，将药对和疾病的共同靶点导入该数据库，并限定物种为人类物种(Homo sapiens)，获得蛋白互作网络图(PPI)，检索研究相关文献，为确保可信度，将交互分数限定为>0.4，去除无相互作用的单一蛋白，获得最终的PPI网络图。

1.7GO功能、KEGG通路富集分析

在DAVID6.8数据平台(https://david.ncifcrf.gov/)传关键靶点，进行GO分析[由细胞组成(cellular component, CC)、分子功能(molecular function, MF)、生物过程(biological process, BP)三部分组成]和KEGG分析，并通过微生信在线平台分别绘制高级气泡图。

1.8构建“成分-关键靶点-通路”网络图

应用 Cytoscape 3.8.0 软件对防风、辛夷药对预测的44个靶点及相对应的32种化学成分，以及靶点相对应的主要通路进行分析，构建核心药物组合成分-关键靶点-通路网络图。

2 结果

2.1药物活性成分及靶点筛选

通过TCMSP数据库，根据OB≥30%和DL≥0.18原则，共筛选得到36种候选药效成分，其中防风18种，辛夷19种，其中共有成分1种，详细信息如表1所示。36个有效成分经进一步搜集共得到潜在有效靶点80个，运用Cytoscape3.8.0绘制“药物-活性成分-靶点”网络图，见图1 ，该网络共包含111个节点，342条边，其中34个节点代表药效成分，77个节点代表与药效成分相关的靶点基因。

表1

图1

2.2变应性鼻炎靶点的获取及药物与疾病交集靶点的获取

在Genecards数据库中搜集变应性鼻炎靶点2073个，考虑靶点基因过多，按Relevance Score分数由高到低进行排序，经两次筛选大于中位数的靶点后，获939个靶点。结合Drugbank、OMIM数据库补充变应性鼻炎靶点，合并去重，共获得疾病靶点1147个。在Venny2.1.0中将筛选出的防风-辛夷活性成分靶点与变应性鼻炎靶点取交集，得到44个共同关键靶点，为CHRM1、CHRM2、CHRM3、CHRM4、CHRM5、SLC6A4、SLC6A3、PTGS1、PGR、NR3C2、PTGS2、GABRA2、IL6、PTGER3、TGFB1、TNF、CXCL8、CCL2、ADRB2、NOS2、FN1、CASP3、MMP1、NOS3、PIK3CG、MAPK14、ESR1、RELA、CASP8、PPARG、AKT1、JUN、BCL2、KDR、PRKCA、DPP4、PON1、HTR2A、RXRB、ADRA1A、AR、KCNH2、ESR2、PRKCD，见图2。

图2

2.3防风-辛夷药对治疗变应性鼻炎的关键靶点PPI网络

为了更好地分析靶点蛋白间的相互作用，将疾病和药对的共同靶点导入String数据库，限定物种为人，为确保数据的可靠性，选择0.4的高置信度，绘制蛋白互作关系网络图，去除无相互作用的单一蛋白，获得最终的PPI网络图，结果见图3。该网络包括44个节点，285条边。根据Degree值筛选出排名前五的靶点分别是AKT1、IL6、NOS3、JUN、MAPK14。

2.4GO功能和KEGG通路富集分析

为进一步阐明关键靶点的可能作用，应用DAVID 6.8数据平台对关键靶点进行GO及KEGG通路富集分析，共有321个GO术语条目，其中细胞组成27个，分子功能49个，生物过程245个，KEGG富集显示92条通路。按P值排序后，取前20条通过通过微生信在线平台分别绘制高级气泡图，见图4。

图3

图4

GO功能富集分析结果显示，细胞组成(CC)主要集中于质膜(plasma membrane)、突触(synapse)、膜筏(membrane raft)、质膜的组成部分(integral component of plasma membrane)、突触后膜(postsynaptic membrane)等部位，见图4a；分子功能(MF)主要集中于酶结合(enzyme binding)、G蛋白偶联乙酰胆碱受体活性(G-protein coupled acetylcholine receptor activity)、类固醇激素受体活性(steroid hormone receptor activity)、类固醇结合(steroid binding)等方面，见图4b；生物过程(BP)主要集中于脂多糖介导的信号通路(lipopolysaccharide-mediated signaling pathway)、细胞对脂多糖的反应(cellular response to lipopolysaccharide)、ERK1和ERK2级联的正调节(positive regulation of ERK1 and ERK2 cascade)等方面，见图4c。KEGG 通路富集分析结果显示，钙信号通路(Calcium signaling pathway)、Toll样受体信号通路(Toll-like receptor signaling pathway)、NOD样受体信号通路(NOD-like receptor signaling pathway)、胆碱能突触(Cholinergic synapse)、肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)、血管内皮生长因子信号通路(VEGF signaling pathway)等20条通路与防风-辛夷治疗变应性鼻炎可能相关，见图4d。

2.5成分-靶点-通路网络图

应用 Cytoscape 3.8.0 软件对防风、辛夷药对预测的44个靶点及相对应的32种化学成分，以及靶点相对应的主要通路进行分析，构建成分-靶点-通路网络图，结果见图5。

图5

3 讨论

防风、辛夷中色原酮、5-O-甲维阿斯米醇、欧前胡素、木兰脂素、Galgravin能匹配到较多的靶点，提示着可能是防风、辛夷治疗变应性鼻炎的关键有效成分。欧前胡素可显著抑制RBL-2H3细胞脱颗粒，并降低组胺及各炎症指标的释放，促进IFN-γ表达，通过免疫调节降低细胞的炎症反应[5]。色原酮能降低血清的IL-1β,IL-6和TNF-α水平,降低炎症反应[6]，从而减轻变应性鼻炎的症状。5-O-甲维阿斯米醇能显著抑制二甲苯引起的皮肤肿胀, 降低炎症反应[7]。木兰脂素具有较强的抗过敏作用，对炎症早起有明显的抑制作用，其抗炎机制与其抑制IL—la的作用有关[8-9]。而Galgravin作为一种有效的抗PAF化合物[10]，对PAF导致的变应性鼻炎可能具有较好的治疗效果。

蛋白质相互作用网络表明，44个关键靶点中，IL6的连接度最高。IL-6是炎症发生最关键的炎症因子，在适应性免疫和慢性炎症等病理过程中起重要作用[11]。王鑫等[12]研究表明，IL6与变应性鼻炎的发病密切相关，Kimura等[13]认为IL-6增强B淋巴细胞的终末分化，放大IgE合成的信号，促使B淋巴细胞成熟为高效合成IgE的细胞，并最终分泌IgE。除此之外，AKT1、NOS3、JUN、MAPK14，这些关键靶点参与多种生物过程，PI3K/AKT 信号通路可以抑制肥大细胞活性和变应性鼻炎的变应性反应，而在此通路中，AKT 发挥着关键的作用[14]。MAPK14参与调控T细胞受体、辅助性T细胞(Th1、Th2、Th17细胞分化)信号通路从而参与机体免疫应答[15]，并且参与细胞的生长分化过程[16]。JUN蛋白质能调节免疫细胞的增殖和分化，且涉及炎症细胞的激活和细胞因子和趋化因子的释放[17]。NOS3的活性被抑制，可控制某些炎症因子所介导的通透性增加[18]，从而减少渗出。

通过GO生物功能富集分析，发现其可以通过影响酶结合、类固醇结合、药物结合、蛋白酶结合、蛋白质复合物结合、受体结合、G蛋白偶联乙酰胆碱受体活性、类固醇激素受体活性、转录因子活性、蛋白酶活性，直接配体调控序列特异性DNA结合、血管生成、突触传递等的作用来治疗变应性鼻炎。KEGG 通路富集分析显示了防风-辛夷疗变应性鼻炎的主要信号通路。研究表明TLRs信号可能通过参与诱导产生Th1和/或 Th2型细胞因子调节过敏性炎症[19-20]。钙信号通路与变应性鼻炎中的T细胞分化有关[21]。NOD样受体信号通路能介导炎症反应，引起Th2细胞因子的释放，加重或维持AR状态，并且能增强免疫应答[22]。因此，Toll受体信号通路、NOD样受体信号通路、钙离子通道可能是防风-辛夷治疗过变应性鼻炎的的潜在靶信号通路。

本研究通过网络药理学研究方法，对防风-辛夷治疗变应性鼻炎的化学成分、靶点、通路之间进行研究，体现了防风、辛夷药对多成分、多靶点、多通路协同作用的特点。但防风-辛夷药对治疗变应性鼻炎的作用机制有待于进一步动物实验或细胞实验的证实。