青蒿琥酯干预对伴糖尿病牙周炎大鼠肠道组织TNF-α、 MMP-9及Caspase 3表达的影响

袁 仲，农晓琳，陈 怡，梁 晨

糖尿病作为临床上常见的慢性内分泌疾病，获得极大的关注，然而其发病机制目前尚不明确。糖尿病的发生发展伴随着多种并发症，其中牙周炎作为一种常见的口腔疾病，因其与糖尿病关系密切又被称为糖尿病的“第六大并发症”。牙周炎是主要由牙周菌斑引起，临床表现为牙周软硬组织局部破坏。伴糖尿病牙周炎因为口腔菌群进一步紊乱、牙周组织浸润性炎症加重而具有临床症状严重、治疗困难易反复等特征。糖尿病与牙周炎往往共存并且相互促进与影响，二者的交互作用又会导致全身多靶器官进一步受损。已有研究指明，体内的高血糖环境会引起肠道屏障功能受损从而引发肠源性感染[1]；另一方面，牙周菌群亦可引起肠道菌群紊乱从而导致肠道内广泛炎症损害[2]。所以我们推测，伴糖尿病牙周炎相较单纯糖尿病或牙周炎可能会进一步加重肠道的破坏而引发相应并发症。

在前期研究中，青蒿琥酯(artesunate,ART)作为青蒿素的水溶性衍生物已经证实在糖尿病多靶器官损伤中的治疗作用。因其具有优秀的抗炎[3]、抗菌[4]等能力，ART在伴糖尿病牙周炎的治疗中可能存在一定的价值。本研究试图通过构建伴糖尿病牙周炎大鼠模型，采用青蒿琥酯干预治疗后，观察青蒿琥酯对伴糖尿病牙周炎大鼠肠道组织的影响，并探究其可能存在的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

取32只6周龄，体重190～210 g，健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(由广西医科大学动物实验中心提供，实验设计经广西医科大学动物伦理委员会批准通过)，随机分为4组，即健康对照组、糖尿病组、伴糖尿病牙周炎组以及ART干预组。分笼适应性喂养1周，自由摄食及摄水。

1.2 各组实验模型建立

第1周末，除健康对照组8只动物外，其余各组共24只大鼠均按下述方法制备1型糖尿病模型。大鼠禁食12 h后，链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)于腹膜下注射60 mg/kg，单次注射。注射3 d后进行糖尿病的成模鉴定，以大鼠尾部静脉血空腹血糖值>16.7 mmol/L作为1型糖尿病模型建立成功指标，且2周内3次重复测量均稳定>16.7 mmol/L者作为糖尿病成模动物进入牙周炎建模实验。

活化保存菌种牙龈卟啉单胞菌菌株(P.gingivalisATCC33277)接种于培养基中，厌氧培养细菌并配制成新鲜菌液。于第3周末在前述成功建立1型糖尿病大鼠模型的基础上，随机选取16只糖尿病大鼠在其双侧上颌第二磨牙采取结扎丝结扎和涂布菌液的方法构建伴糖尿病牙周炎模型。0.5%戊巴比妥钠麻醉后，探查双侧上颌第二磨牙并分离牙龈，采用 4-0 正畸结扎丝在龈沟内结扎，将配置完备的牙龈卟啉单胞菌菌液涂布于结扎丝上及龈沟内深入结合上皮处。建模后每周探诊并补充涂布菌液，若牙周袋形成则将结扎丝进一步推进至牙周袋底。至第10周末，伴糖尿病牙周炎大鼠建模成功。

1.3 药物干预及标本采集

第10周末，大鼠糖尿病及牙周炎模型稳定，一般状况稳定。对ART干预组大鼠进行ART干预，健康对照组、糖尿病组、伴糖尿病牙周炎组均给予生理盐水对照干预。本实验采用60 mg/kg浓度ART对ART干预组大鼠进行灌胃处理。每天干预1次，共持续4周。在ART干预过程中对健康对照组、糖尿病组以及伴糖尿病牙周炎组大鼠每日给予同量生理盐水灌胃处理。第14周末处死大鼠，剪取距回盲端5 cm的回肠2 cm长，于4% 多聚甲醛溶液中固定保存。

1.4 观察指标

1.4.1 肠道上皮组织病理学观察 大鼠肠道组织常规固定、脱水、包埋，肠腔横断面切片4 μm 厚，每份标本各切片4张备用，苏木精-伊红(HE)染色对各组大鼠肠道上皮组织病理学改变进行观察。

1.4.2 免疫组织化学染色观察肠道上皮肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、基质金属蛋白酶-9(matrix metallopeptidase-9, MMP-9)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3(cysteinecontaining aspartate-specific proteases 3, Caspase 3)表达 取上述切片，浸没于枸橼酸溶液中，使用高压锅进行高压抗原修复。5 min后将其取出自然冷却，洗涤后在3%过氧化氢溶液中浸泡。PBS冲洗，山羊血清封闭。选择一抗：兔抗鼠TNF-α、MMP-9、Caspase 3(均购自Bioworld公司，中国)，滴加1∶100稀释抗体。过夜后滴加羊抗鼠抗兔通用型HRP标记二抗(武汉博士德公司，中国)。二抗孵育后PBS冲洗3次，DAB显色，复染，干燥，封片。以肠道上皮组织内棕黄色颗粒状黄染作为阳性指标，镜下随机选取5个视野，采用Image Pro Plus 6.0图片分析软件分析计算肠道上皮组织中TNF-α、MMP-9及Caspase 3光密度值。

1.5 统计学方法

SPSS 22.0统计分析软件处理分析实验结果，4组数据比较先进行方差齐性检验。如果方差齐则对数据行单因素方差分析，并采用SNK-q做组间两两比较；若方差不齐则行秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肠道组织HE染色观察结果

各组大鼠回肠HE染色图像见图1。可见健康对照组大鼠肠道上皮各层分界清楚、排列整齐，肌层完整无破坏，肠腺排列较整齐，绒毛呈指状无萎缩无断裂。糖尿病组大鼠肠道黏膜结构有破坏，具体表现为肌层损伤，肠绒毛萎缩，肠腺减少并伴有变形。伴糖尿病牙周炎组大鼠肠道上皮破坏较糖尿病组表现明显且严重，具体体现为肌层损坏加重伴有“剥脱样”改变，肠腺萎缩变形周围多淋巴细胞浸润，肠绒毛排列不整伴有粘连。ART干预组大鼠肠道肌层完整，绒毛排列整齐，淋巴细胞浸润较伴糖尿病牙周炎组减轻。

图1 各组大鼠肠道组织HE、免疫组化染色结果( ×200)

2.2 肠道组织TNF-α, MMP-9及Caspase 3免疫组化染色观察结果

TNF-α是炎症信号通路的一种表达因子，在正常肠道组织中较少表达在绒毛内细胞间质以及黏膜下层，表现为棕黄色及棕红色颗粒状、片状深染。根据图像分析结果，伴糖尿病牙周炎组TNF-α阳性表达水平最高，糖尿病组阳性表达次之，ART干预组及健康对照组表达最低。其中，ART干预组与健康对照组差异无统计学意义(P>0.05)，其余健康对照组、糖尿病组、伴糖尿病牙周炎组及ART干预组两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1、2。

MMP-9是一种基质金属蛋白酶，在正常肠道中肠绒毛及腺泡周围细胞间质较少表达或不表达。图像分析结果示：伴糖尿病牙周炎组及糖尿病组MMP-9阳性表达水平最高，ART干预组表达次之，健康对照组MMP-9表达最低。各组两两比较，ART干预组与健康对照组、糖尿病组与伴糖尿病牙周炎组之间差异无统计学意义(P>0.05)，其余各组差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1、2。

Caspase 3参与调控细胞凋亡，在正常肠道上皮中不表达或很少表达。在伴糖尿病牙周炎组及糖尿病组中Caspase 3表达最高，在ART干预组表达较低，在健康对照组中表达最低。SNK-q分析，伴糖尿病牙周炎组与糖尿病组差异无统计学意义(P>0.05)，其余均有统计学意义(P<0.05)。见图1、2。

*:P<0.05, **:P<0.01, ***:P<0.001, n=8

3 讨 论

糖尿病会使全身多靶器官处于慢性高炎症状态从而导致多种并发症状。已有研究表明，糖尿病会引起肠道内环境改变，继而引发肠道内慢性炎症改变、肠道通透性增加、肠道上皮破坏等一系列病损。其中，肠道微生物失衡可能作为糖尿病致肠道炎症的一条重要途经。Zhang等[5]通过16SrDNA肠道菌群测序的方法，发现随着葡萄糖耐受不良的进展，肠道内拟杆菌属和梭菌属富集程度发生波动，链球菌则呈现持续下降趋势。而这种菌群结构紊乱，则会导致肠腔内乳酸菌等益生菌显著减少，革兰阴性肠道病原菌占比大幅增加，产生大量内毒素，使肠道屏障功能受损，肠道上皮炎症浸润。Thaiss等[1]发现在糖尿病的小鼠模型中，高血糖环境通过肠道上皮细胞的葡萄糖转运蛋白(glucose transporter type 2, GLUT2)来驱动肠屏障通透性，由此得出高血糖介导的屏障破坏会导致微生物产物的全身流入并增加肠道感染。

口腔和肠道通过消化道连接，二者在微生物构成及致病方面有着多种多样的联系。牙周炎作为口腔局部炎症会对肠道内菌群结构组成产生远隔影响。Tamotsu等[6]对小鼠口服牙龈卟啉单胞菌以观察肠道内微生物改变，发现口服牙龈卟啉单胞菌后肠道内拟杆菌及普氏菌增加，肠道菌群结构发生改变。这表明，与牙周炎关系密切的细菌会导致肠道内细菌构成发生改变。然而值得注意的是，牙龈卟啉单胞菌并不直接在小鼠肠道中检出，由此可推断牙周炎并不通过细菌直接定植方式改变肠道菌群结构，而是通过其他途径影响肠道内环境。Nakajima等[7]研究发现，小鼠口服牙龈卟啉单胞菌会引起血清内毒素水平增加，且肠道上皮中与肠道通透性相关蛋白基因水平下调。这提示牙周炎可能通过牙周组织内过量革兰阴性菌释放内毒素进入外周血，通过体循环至肠道组织，引发肠道上皮内广泛炎症，破坏肠道屏障，进入肠腔，改变肠道微生态结构。

由此可见，糖尿病及牙周炎可分别引起肠道上皮受损及炎症。因此，伴糖尿病牙周炎作为临床上常见的一种伴发疾病会引起肠道组织更严重的破坏。通过实验我们证实了这一点：糖尿病及伴糖尿病牙周炎大鼠相较健康对照组大鼠肠道组织结构有破坏，TNF-α、MMP-9及Caspase 3表达均较高，且伴糖尿病牙周炎组大鼠较糖尿病组大鼠TNF-α、MMP-9及Caspase 3表达更突出。

在对糖尿病及牙周炎两种疾病的研究中，炎症信号通路一直是关注的焦点。TNF-α是核因子-κB(nuclear factor kappa-B， NF-κB)信号通路的一种促炎因子，其在糖尿病相关靶器官及牙周炎症组织中均有高表达[8]。在本实验研究中，伴糖尿病牙周炎大鼠肠道上皮内TNF-α表达较正常大鼠显著增加，提示伴糖尿病牙周炎通过炎症信号通路影响、破坏肠道上皮组织。MMP-9在炎症性肠病领域有着较为重要的作用。Garg等[9]发现，MMP-9能够调节肠道组织中杯状细胞的分化，这改变了肠道黏膜的防御屏障，从而导致了肠道炎症。也有研究发现，牙周炎患者牙周菌群的构成与TNF-α、MMP-9等因子有显著的相关性[10]。本次实验结果得出：与正常大鼠相比，糖尿病及伴糖尿病牙周炎大鼠肠道组织中MMP-9水平提高，由此可见伴糖尿病牙周炎对肠道炎症损伤作用显著。Caspase 3是一种半胱氨酸蛋白酶，其在细胞凋亡中起到重要作用。有研究指出，脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)在肠道内过量生成会导致肠道上皮细胞凋亡，Caspase 3表达随之增加[11]。另外有研究表示，TNF-α可作为独立因子诱使肠道上皮细胞触发凋亡信号通路引起肠道上皮损伤[12]。在本实验中，糖尿病组及伴糖尿病牙周炎组较健康对照组大鼠Caspase 3水平增加，且伴糖尿病牙周炎大鼠增加更明显，这提示糖尿病及牙周炎二者交互作用使肠道上皮细胞非正常凋亡。所以我们推测，糖尿病通过糖基化终产物途径(AGEs-RAGE)，激活了NF-κB信号通路，引发TNF-α、MMP-9等下游因子表达增加[13]；另一方面，牙周炎导致的牙周菌群失调也进一步促进了LPS、TNF-α、MMP-9等的表达。而LPS、TNF-α的过表达，引发了肠道上皮内细胞凋亡通路的激活，从而导致Caspase 3等凋亡因子的阳性表达。

ART是青蒿素的一种倍半萜内酯衍生物，因其是青蒿素的水溶性衍生物，在用药方面具有多种给药途径，所以在临床上应用广泛。已有研究表明，ART具有多种药理作用，如抗疟疾[14]、抗炎、抗肿瘤[15]、抗真菌等[16]。我们的前期研究发现ART具有一定程度的抗瘢痕形成能力[17]；ART对糖尿病大鼠肾脏、心脏等靶器官具有一定的治疗作用[18-19]。值得关注的是，有研究表明ART对多种细菌表现出明显抗菌动力学特征。Li等[20]指出ART可以有效抑制大肠杆菌抗药性，促进β-内酰胺类抗生素对大肠杆菌的抑制作用。ART可通过改善肠道菌群结构，抑制肝硬化所致肠道菌群移位并一定程度减轻肝硬化程度[21]。在Kim等[4]的研究中发现，青蒿素及其衍生物对伴放线聚集杆菌、中间普氏菌等多种牙周致病菌表现出明显的抗菌活性，分析指出因其可对牙周炎相关炎症因子及牙周炎进程产生抑制作用，从而抑制各类牙周致病菌。有研究ART对风湿性关节炎的作用机制中发现，ART可以通过抑制磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)等通路降低下游产物MMP-9的表达[22]，这与我们的实验结果相符，表明ART可通过降低MMP-9的表达从而缓解肠道炎症。另有研究表明，ART可以通过抑制NF-κB的表达从而影响下游产物亚硝酸盐、TNF-α的产生，达到抑制高血糖环境所致的慢性炎症作用[23]。已有研究证实ART对1型糖尿病小鼠有确切的治疗作用，并可有效抑制胰腺中TNF-α、IL-6等促炎因子的表达[24]。而在牙周炎的治疗中，研究人员亦发现ART有剂量依赖性地抑制NF-κB诱导的破骨细胞及LPS的生成的作用[25-26]。在本次实验中，我们发现ART对伴糖尿病牙周炎大鼠肠道组织形态损伤、炎症浸润及上皮细胞凋亡有明显抑制作用，肠道组织恢复情况良好。我们推测，ART可能通过抑制牙周致病菌及抑制肠道内革兰阴性致病菌，调整肠道菌群结构，减少内毒素产生，从而恢复肠道屏障，抑制肠道上皮炎症。另一方面，ART的干预可能通过抑制PI3K/Akt、NF-κB等通路，减少因糖尿病及牙周炎导致的TNF-α、MMP-9及Caspase 3等因子的过表达，从而达到改善肠道上皮的破坏。

综上所述，我们初步发现伴糖尿病牙周炎对肠道组织的破坏，糖尿病及牙周炎二者协同作用，加重肠道上皮炎症及细胞凋亡。ART干预后肠道上皮结构明显改善，TNF-α、MMP-9及Caspase 3炎症因子及细胞凋亡因子显著下调，提示ART对伴糖尿病牙周炎肠道损伤有一定治疗作用，关于具体通路上下游因子的研究仍需进一步探讨。可以进一步探讨ART作为治疗伴糖尿病牙周炎的有效药物与胰岛素的对照研究以及研究二者联合应用的治疗效果及机制。