超声辅助[C4m im]Br/(NH4)2SO4双水相提取柿叶中总黄酮

周艳红

（陕西国际商贸学院，陕西 西安712046）

双水相萃取是利用目标物质在两相间的溶解度即分配系数不同而实现分离的一种技术手段，其传质快、试验条件及操作环境温和，离子液体[1]是新一代绿色设计溶剂,具有优异的溶剂化性能，离子液体双水相[2-6]在萃取方面显示了良好的应用前景。

柿叶中含有丰富的维生素、芦丁以及铁、锌、钙等对人体健康有益的多功能营养成分，现代药理学研究表明柿叶具有清热解毒、润肺强心、镇咳止血、改善血管通透性等多种医疗保健功能，黄酮作为柿叶的有效成分之一，具有降血糖、抗菌、抗肿瘤、止血、调血脂、改善微循环等药理作用，药用价值高，开发前景乐观。

目前，国内对柿叶中总黄酮[7,8]的研究报道颇多，但都集中于传统的有机溶剂萃取方面。本实验用离子液体双水相作为提取剂对柿叶有效部位总黄酮进行了提取，效果较好，为柿叶的开发利用提供实验依据。

1 实验部分

1.1 材料、试剂与仪器

柿子叶，采摘于陕西省西安市西咸新区树叶林。

芦丁标准品（含量>98%，批号：100080-201202），中国食品药品检定研究院；离子液体，阿拉丁试剂（上海有限公司）；硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠等均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

UV-2102PC型紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司），KQ-250DE型医用数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司），D5-R2型离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司），电子天平（北京赛多利斯天平有限公司），多功能粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）。

1.2 标准曲线的绘制

以芦丁为标准物，测定510 nm处的吸光度,芦丁溶液浓度（c）为横坐标，吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程：Y芦丁=1.3643X+0.0047(R2=0.9999)。

1.3 柿子叶的预处理

将柿子叶于60℃烘干至恒重，粉碎，过筛，取干燥后的柿子叶粉若干，加入石油醚，用索氏提取器进行脱色处理，然后将得到的柿子叶粉置于阳光下，除去其中的石油醚，装入密封袋中，备用。

1.4 柿叶中总黄酮含量的测定

向25mL具塞磨口锥形瓶中加入一定质量的[C4mim]Br离子液体和(NH4)2SO4，用蒸馏水补充，使整个离子液体/盐体系质量维持在5 g，混合物充分搅拌至盐完全溶解后加入一定质量的样品粉末m（g），调节pH，在适当的温度条件下萃取一定时间，参比溶液加入相同（样品粉末除外）的成分。溶液形成两相，上相富含离子液体及黄酮，杂质留在盐相中，记录上层液体的体积（Vt）、下层液体的体积（Vb）。按标准曲线测定方法测上层溶液和下层溶液的吸光度A，根据标准曲线方程计算出上相黄酮浓度（Ct）和下相黄酮浓度（Cb）。

相比：R=Vt/Vb

分配系数：kd=ct/cb

提取率（mg·g-1）=Vt·ct/m

1.5 提取工艺优化

在超声功率为100W的条件下，进行单因素实验，分别考察料液比、提取时间、提取温度和离子液体浓度对总黄酮提取率的影响，依据Box-Behnken中心组合实验设计原理，在单因素的基础上选择提取时间（A）、离子液体浓度（B）、提取温度（C）为考察因素，利用响应面法优化柿子叶中总黄酮的工艺参数。

1.6 双水相体系的确定

同等条件下选取不同碳链长度的离子液体[C2mim]Br、[C4mim]Br、[C6mim]Br、[C8mim]Br/(NH4)2SO4双水相体系提取柿叶中的总黄酮，阳离子碳链长度对黄酮类化合物提取量的影响如图1所示。由图1可以看出，烷基链由乙基增大到丁基，提取量逐渐增大。当碳链长度继续增长，提取量不增反降，因此选取[C4mim]Br/(NH4)2SO4为本实验的双水相体系。

图1 不同离子液体柿叶中总黄酮的提取率

2 结果与讨论

2.1 单因素考察柿叶中总黄酮的提取工艺

2.1.1 离子液体浓度对黄酮提取率的影响

在[C4mim]Br/(NH4)2SO4双水相体系中，提取时间为40min，提取温度为50℃，料液比为1∶20，分别加入浓度为0.5mol/L、0.6mol/L、0.7mol/L、0.8mol/L、0.9mol/L、1.0mol/L的离子液体[C4mim]Br。由图2可知，当[C4mim]Br浓度小于0.7mol/L时，柿子叶总黄酮提取率和分配系数随[C4mim]Br浓度的增加而增大，这主要是因为[C4mim]Br与黄酮类化合物之间形成π-π相互作用，并且水与离子液体、总黄酮可形成氢键网络，在亲水极性区形成的网络结构可以增加总黄酮的亲水性，使其在极性区稳定地存在，促进了总黄酮在两相间的转移；当浓度等于0.7mol/L时，柿子叶总黄酮和分配系数达到最大，说明有更多的黄酮富集在离子液体中；离子液体大于0.7mol/L时，柿子叶总黄酮和分配系数随浓度增加而减小，因为当离子液体浓度过大时，体积排阻效应增大导致总黄酮在相间的传递以及在相中的扩散阻力大大增加，阻碍了总黄酮进入离子液体相，分配系数、提取率逐渐降低。所以离子液体[C4mim]Br最佳浓度为0.7mol/L。

图2 离子液体浓度对分配系数和黄酮提取率的影响

2.1.2 提取温度对总黄酮提取率的影响

在[C4mim]Br/(NH4)2SO4双水相体系中，提取时间为40min，料液比为1∶20，离子液体浓度为0.7mol/L，选 取 提 取 温 度 为40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃。由图3可知，当体系温度低于60℃时，柿叶总黄酮的分配系数和提取率随温度升高而逐渐增大，其原因是温度升高，上相离子液体中富集的黄酮含量增多；温度大于60℃时，柿叶总黄酮的分配系数和提取率随温度的升高逐渐减小，主要是因为温度过高会导致黄酮分解，同时温度过高会使硫酸铵分解，盐析能力降低，离子液体与黄酮的相互作用力减小，使上相离子液体相中黄酮含量不再增多甚至因分解而减小，导致分配系数和提取率减小。所以综合考虑，选择最佳的提取温度为60℃。

图3 提取温度对分配系数和黄酮提取率的影响

2.1.3 提取时间对总黄酮提取率的影响

在[C4mim]Br/(NH4)2SO4双水相体系中，提取温度为60℃，料液比为1∶20，离子液体浓度为0.7mol/L，选取提取时间为30min、40min、50min、60min、70min、80min。实验结果如图4所示：分配系数和提取率随着提取时间的增加而逐渐增大，主要是因为上相离子液体富集的黄酮含量随着时间的增加而增大。当提取时间大于50min时，分配系数和总黄酮提取率减小，推测主要是因为黄酮在长时间机械效应和热效应下不稳定，发生分解或转化为其他物质，导致提取量降低。确定50min为最适宜超声时间。

图4 提取时间对分配系数和黄酮提取率的影响

2.1.4 料液比对总黄酮提取率的影响

在[C4mim]Br/(NH4)2SO4双水相体系中，提取温度为60℃，提取时间为50min，离子液体浓度为0.7mol/L，选取料液比为：1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35。实验结果如图5所示，分配系数和提取率随料液比增加而增大，在1∶25时最大.随后逐渐减小，主要是因为料液比大于1∶25时，柿子叶粉质量较大，不利于柿子叶粉的溶解和扩散，溶剂中黄酮类物质的溶出受到影响，而料液比小于1∶25时，总黄酮已基本完全溶出，因此提取量不再增加，且会增加浓缩成本，导致提取量降低，确定料液比最佳条件为1∶25。

图5 料液比对分配系数和黄酮提取率的影响

2.2 响应面法实验结果

2.2.1 响应面试验结果及方差分析

在单因素试验的基础上，选取离子液体浓度（A）、提取时间（B）和提取温度（C）等3因素按照Box-Behnken中心组合设计方案进行优化试验[9,10]，结果如表1及表2所示。

表1 星点设计因素与水平

表2 响应面试验以及响应值

对表2中数据进行回归拟合，获得拟合方程为Y=26.63-0.00875A+0.00375B+0.43C+0.23AB-0.34AC+0.29BC-0.72A2-0.68B2-0.58C2对回归方程进行方差分析。由表3可以看出，试验回归模型P＜0.01，说明回归模型达到高度显著水平；失拟项P=0.2803＞0.05，失拟项不显著，说明试验数据与模型拟合良好。该模型拟合的最佳提取工艺为离子液体浓度为0.7mol/L，超声时间为50.00 min，超声温度为60℃，在该条件下预测总黄酮提取量可以达到26.62 mg/g，A2，B2，C2的P值均小于0.05，说明提取时间、提取浓度、提取温度对柿子叶中总黄酮的提取量有很大的影响。

表3 响应面方差分析表

2.2.2 响应面分析

根据Box-Behnken软件分析实验数据并获得响应模型，保持三个变量因素中的一个不改变，得到离子液体浓度、提取时间、体系温度之间其他两个因素之间的三维响应面曲线和轮廓曲线，所得结果见图6（a）、6（b）和6（c）。根据Box-Behnken软件模型所得的结果和统计学进行方差分析（ANOVA）获得离子液体双水相各个因素的最佳组合条件为浓度为0.7mol/L，超声时间为50min，超声温度为60℃，黄酮提取量可以达到26.62mg/g。

图6 响应模型

2.2.3 验证实验

为验证该拟合模型的可靠性，同时为了试验操作实施的便利，在离子液体浓度为0.7mol/L、超声时间50min、超声温度60℃条件下，固定其他各因素不变，进行3次平行试验。结果在该工艺条件下，柿子叶总黄酮提取量为26.84mg/g，与预测值之间相差较小，说明该模型能够很好地拟合柿子叶总黄酮的提取过程，优化得到的最佳提取条件参数可靠性较好。

2.2.4 对比实验

分别以同浓度乙醇、离子液体、离子液体/(NH4)2SO4体系提取柿叶中的黄酮，时间为50min，温度为40℃，料液比为1∶10，从表4可以看出双水相体系的提取率最高。

表4 三种提取剂的对比研究

2.2.5 柿叶总黄酮抗自由基实验结果

对柿叶中总黄酮及Vc对DPPH自由基、羟自由基以及超氧自由基的清除能力进行了研究[11]，结果如表5。结果表明柿叶总黄酮具有较高的清除DPPH自由基和羟自由基的能力，对DPPH自由基的清除率达到86%，略高于同浓度的Vc。对羟自由基的清除率达到68%，高于同浓度的Vc，而对超氧自由基清除能力低于Vc，清除率只有30%，比同浓度的Vc低了10%。

表5 对自由基的清除实验结果

3 结论

本文采用超声辅助[C4mim]Br/(NH4)2SO4双水相提取柿叶中的总黄酮，确定离子液体的种类，离子液体的浓度，超声提取时间、温度和液固比值为影响提取率的因素，并优化了提取条件。离子液体提取黄酮类化合物的最佳条件为：离子液体种类为[C4mim]Br，离子液体浓度为0.7mol/L，提取时间为50分钟，提取温度为60℃，液固比为1∶25。此时提取黄酮类化合物的效率最高。与无水乙醇作为提取剂提取柿叶中的黄酮的方法相比，具有特殊结构性质的离子液体能够更好地溶解出柿叶中的黄酮类物质，优化的工艺为工业规模生产提供了参考数据。