碳点促进作物种子萌发及生长的机制研究

刘振玲 李亚伟 杨涵越 刘晓飞 王传洗

摘要 [目的]研究碳点（CDs）对作物种子萌发及生长的影响。[方法]采用微宇宙培养系统，探究10 mg/L下CDs处理对菠菜（伏播611）种子发芽性能及幼苗生长的影响。[结果]在菠菜种子培植10 d后，CDs处理的菠菜种子萌发率为69.0%，显著高于对照组（46.0%，P<0.05）。CDs增加了菠菜幼苗的生物量，相对于对照组，鲜重提高30.1%，干重提高55.3%。CDs上调了菠菜种子的水通道蛋白基因表达，增加对水分的吸收，促进菠菜种子萌发及生长。[结论]CDs可以作为一种优良的纳米材料应用于现代农业发展中，特别是应用在作物种子的萌发及生长方面。

关键词 碳点;菠菜种子;萌发;幼苗生长;水通道蛋白基因

中图分类号 Q945  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）24-0001-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.24.001

Study on the Mechanism of Carbon Dots Promoting Crop Seed Germination and Growth

LIU Zhen-ling1，LI Ya-wei1，YANG Han-yue2 et al （1.Wuxi New Vision Environmental Protection Co.，Ltd.，Wuxi，Jiangsu 214135;2.Institute of Environmental Processes and Pollution Control，School of Environment and Civil Engineering，Jiangnan University，Wuxi，Jiangsu 214122）

Abstract [Objective]To study the effects of carbon dots （CDs） on the germination and growth of crop seeds.[Method]A microcosmic culture system was used to explore the effects of CDs （10 mg/L） on the germination performance and seedling growth of spinach （Fubo 611）.[Result]After the spinach seeds were cultivated for 10 days，the seeds germination rate treated with CDs was 69.0%，which was significantly higher than that of the control group （46.0%，P<0.05）.CDs increased the biomass of spinach seedlings relative to the control group （fresh and dry weight increased by 30.1% and 55.3%，respectively）.CDs up-regulated the aquaporin gene expression of spinach seeds，increased water absorption，and promoted the germination and growth of spinach seeds.[Conclusion]CDs can be used as excellent nanomaterials for developing modern agriculture，especially in the germination and growth of crop seeds.

Key words Carbon dot;Spinach seed;Germination;Seedling growth;Aquaporin gene

基金项目 中央高校基本科研业务费专项资金（JUSRP221023）。

作者简介 刘振玲（1981—），女，江苏徐州人，高级工程师，硕士，从事环境评估和治理研究。*通信作者，研究员，博士，博士生导师，从事环境功能材料研究。

收稿日期 2021-04-14

我國是一个农业大国，长期面临着人多地少、资源短缺、粮食不足的压力。农业生产过多依赖资源消耗，农业环境污染问题日益突出。因此，如何探索出一条高效、安全、资源节约、环境友好的可持续农业发展道路，是当前必须应对的重大挑战。近年来，以人工纳米材料（engineered nanomaterials，ENMs）生产的纳米化肥、纳米农药、纳米农业传感器等新颖纳米农业产品，在提高作物产量和品质、降低资源投入、减少农业环境污染等方面已经显现出巨大潜力[1-3]。已有研究表明，250  mg/kg CeO2 ENMs 在土壤中能够抑制番茄镰刀菌的生长，比对照组降低53%[4];100 mg/L CuO ENMs能够提高水稻产量25%[5];500  mg/kg TiO2 ENMs 能够增加麦粒中所有氨基酸的含量，而同等浓度下Fe2O3 ENMs只能增加半胱氨酸和酪氨酸的含量[6];0.8 mg/L Fe3O4 ENMs能够促进草莓组培苗的生长并提高其对干旱胁迫的抗性[7];水培条件下50 mg/L的γ-Fe2O3 ENMs分别提高柚子幼苗叶绿素含量和根系活力23.2%和23.8%[8]。尽管这些金属或金属氧化物的ENMs可以有效调控作物产量及品质，但农业中的不当使用或过度使用仍会损害生态系统并造成实质性问题。

碳点（carbon dots，CDs）作为一类新兴的碳基荧光ENMs，由于其表现出的优良性能，如光吸收较宽、荧光可调、发光效率高、抗光漂白、化学稳定性高、生物相容性好、低毒性等，被广泛应用于生物成像、药物递送、催化、光电器件等领域[9]。近年来，CDs被证实能够促进作物生长，改善植物的光合作用，增强植物的抗性及固氮能力[10-11]。例如，0.02 mg/L 的CDs可以提高绿豆芽鲜重14.9%，促进光合产物碳水化合物的合成（21.9%）[10];0.1和100.0  mg/kg的碳黑材料可以增强大豆固氮作用（91%以上）[11]。前期研究表明石墨烯类ENMs具有丰富的含氧官能团，能够增加水分的输送，促进种子萌发[12]。

种子的萌发在植物生长周期过程中属于一个极为关键的时期，也是对非生物环境因子极为敏感的阶段。植物幼苗能否迅速健壮的生长与种子萌发能力密切相关。研究发现，CDs在种子发芽阶段发挥着重要的作用。CDs（0.56 mg/mL）显著促进水稻种子的萌发[13];25%的CDs溶液可以在5 d时促进绿豆种子发芽[14]。然而CDs促进种子萌发的机制有待进一步研究。菠菜（Spinacia oleracea L.）富含丰富的胡萝卜素、维生素C、氨基酸以及Fe、P、Na、K等矿质元素，是我国食用的重要绿叶蔬菜之一[15]。因此，该研究选取菠菜作为供试作物，揭示CDs促进种子萌发及生长的机制，以期为CDs在农业中的应用提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料 该试验于江南大学环境过程与污染控制研究所进行。供试菠菜种子（伏播611）购于河北大禹种业有限公司。CDs合成原料柠檬酸购自国药集团化学试剂有限公司，尿素购自上海泰坦科技股份有限公司。试验所用去离子水为实验室自制。试验用土为潮土，土壤基本理化性质为pH 7.5、有机质20 mg/kg。

该试验所用CDs为自制：取柠檬酸1.0 g和尿素0.5 g，溶解于40 mL纯水中，装入50 mL高压反应釜中，在180 ℃的烘箱中反应10 h后，经过滤，收集溶液，随后将所收集的溶液通过真空冷冻干燥机（中国上海比朗FD-1A-50）干燥得到样品[16]。

1.2 试验方法

1.2.1 CDs悬浮液的制备。

从制备的CDs样品中称取一定量加入纯水中，将溶液在20 ℃下利用超声波细胞粉碎机（新芝SCIENTZ-IID）进行超声处理（200 W，20 kHz）10 min，使其均匀分散于水中形成納米材料悬浮液，最终制备出浓度为10 mg/L 的CDs悬浮液。

1.2.2 CDs性质的表征。

通过透射式电子显微镜（TEM，日本电子株式会社JEM-2100）观察CDs形态与粒径分布，利用X射线光电子能谱（XPS，美国赛默飞ESCALAB 250Xi）和傅立叶转换红外光谱仪（FTIR，德国布鲁克TENSOR 27）测定CDs表面的主要官能团种类及其元素组成。

1.2.3 菠菜发芽试验。

选取直径5 cm、铺有1层定性滤纸的塑料培养皿，挑选大小均匀饱满的42粒菠菜种子（伏播611），用0.05%的次氯酸钠溶液浸泡 30 min 以除去表面细菌，再用去离子水多次冲洗后培育于培养皿，均匀排布。将纯水和处理浓度为10 mg/L的CDs溶液分别喷施于培养皿中，将培养皿用封口膜密封后于25 ℃下避光培养。

选取长54 cm、宽28 cm，共50穴的育苗穴盘，其中12个穴位铺满土壤。试验设计3个处理，分别为空白（CK）以及2个碳点（CDs1和CDs2）处理，每个处理4个穴位，挑选大小均匀的108粒菠菜种子（伏播611），用0.05%的次氯酸钠溶液浸泡 30 min 以除去表面细菌，再用去离子水多次冲洗后培育于育苗穴盘中，每个穴位播种9粒种子，均匀排布。将纯水和处理浓度为10 mg/L的CDs1和CDs2溶液分别喷施于育苗穴盘中，将育苗穴盘放于25 ℃下避光培养。

1.3 测定方法

1.3.1 发芽率。试验测试期间每日记录菠菜种子的发芽数，试验结束后计算菠菜种子的发芽率，计算公式为：发芽率=（发芽种子总数/供试种子总数）× 100%。

在试验测试期间种子幼根或子叶伸出种皮视为萌发，只有幼根超过1 mm才被记为根长。

1.3.2 生物量。

在发芽试验结束后，收集菠菜幼苗，利用电子天平测定其鲜重，通过烘箱干燥后，测定其干重。

1.3.3 根参数。

在发芽试验结束后，收集菠菜幼苗，利用扫描仪（Scanner，日本爱普生12000XL）测定菠菜幼苗的长度和表面积。

1.3.4 水通道蛋白表达量测定。

选定2条PIPs基因特异性引物进行荧光定量PCR分析[17]。在对菠菜进行发芽处理5 d以后，用液氮快速冷冻菠菜幼苗，并仔细研磨至呈粉末。采用通用植物总RNA提取试剂盒（Takara，Japan）提取菠菜幼苗的总RNA。提取的RNA用超微量分光光度计测定样品的纯度和浓度，检验合格的RNA进行后续反转录试验。随

后用RNA反转录试剂盒（Takara，Japan）将符合要求的RNA样品反转录成cDNA，-80 ℃保存备用。

1.4 数据分析 所有数据均采用OriginPro 2016 SR0程序进行分析。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）对空白和处理组的平均值进行比较，分析结果进行Tukey-Kramer检验，P<0.05时，试验结果具有统计学显著性差异。

2 结果与分析

2.1 CDs ENMs的表征

试验用的CDs ENMs采用一步水热法制备[16]，其结构、尺寸、表面化学性质由电子透射显微镜（TEM）、傅立叶转换红外线光谱（FTIR）和X射线光电子能谱（XPS）进行表征。从TEM照片（图1）可以看出，CDs尺寸分布均在10 nm以下，平均尺寸为（5.5±0.3）nm，呈规则圆形颗粒状。FTIR结果证实CDs的主要官能团包括—OH、

CO、CC

等（图2）。由XPS结果（图3）可知，CDs的主要元素组成是C、N、O，并且有吡啶氮、吡咯氮、石墨氮等结构存在。高分辨XPS结果（图4）表明，CDs ENMs表面具有多种亲水官能团，与FTIR结果非常一致。这些官能团赋予了CDs优异的水相分散性。据报道，含有sp2和sp3混合結构的氧化石墨烯，可以作为优良的水分传递剂，增加土壤保水作用，从而促进种子萌发[12]。因此，拥有相似结构的CDs ENMs可能也有类似的水分传递作用。

2.2 CDs ENMs在水环境中对菠菜种子发芽及生长的影响

从图5可以看出，CDs ENMs（CDs1）能够显著促进菠菜种子的萌发。从第4天至第10天，施加CDs1的菠菜种子的发芽率均明显高于对照组;在第10天时，施以CDs1的菠菜种子发芽率为69.0%，而对照组为46.0%，比较对照组，CDs1处理使得发芽率提高50.0%（图6）。除此之外，CDs1也显著增加了菠菜干鲜重，相比于对照，鲜重增加了30.1%，干重增加了55.3%（图7a）。同时，CDs1对于菠菜根、茎形态的发育均有促进作用，主要体现在茎长和表面积方面（图7b、图7c和图8）。CDs1能够增加菠菜种子的长度，地上部增加43.4%，根部增加69.4%（图7b）。CDs1能够增加菠菜根、茎的表面积，根表面积增加44.8%，茎表面积增加38.7%（图7c）。由此可见，CDs ENMs在水环境中不仅可以提高种子的萌发率，而且能够提高幼苗的生物量。

2.3 CDs ENMs在土壤中对菠菜种子发芽及生长的影响

种子萌发往往在土壤中进行，促进种子在土壤中发芽及生长更具有农业操作价值。为了验证在土壤中CDs ENMs（CDs1）对菠菜种子发芽的影响，该研究设计了土施试验，结果表明（图9～10），土壤培育19 d，CDs1能够显著促进对菠菜种子发芽，其发芽率及生长远远高于对照组。同时，该研究采用另外一种结构相似的CDs ENMs（CDs2），进行施用作为另一个处理组。由图9可知，施用CDs2的菠菜种子的萌发率及生长也高于对照组。此结果说明在土壤培植菠菜时，施用CDs可以很好地促进菠菜种子发芽及生长。

2.4 CDs ENMs促进菠菜种子萌发的机制研究

水分在种子发芽中起着至关重要的作用。在发芽开始时，种子中的水溶物质开始吸收水分;而当胚胎开始发育时，种子继续需要吸收大量水分。为了探究CDs对菠菜种子吸水能力的影响，该研究测定了控制水分吸收的水通道蛋白的调控基因。PIPs基因表达结果表明，经CDs处理的菠菜种子相比于对照组，其水通道蛋白基因表达量显著增加（图11）。对于

菠菜水通道蛋白调控基因的2种基因（SoPIP1;2和SoPIP2;1）而言，CDs处理组基因表达量分别显著提高409.0%、156.0%（图11）。施加CDs的菠菜幼苗含水率显著高于对照组，这与水通道蛋白基因表达的结果相吻合。Li等[18]研究发现硅量子点（0.01～0.30 mg/mL）可以提高黄瓜幼苗根部的水通道蛋白基因表达，从而促进幼苗生长。因此，该研究结果表明CDs可以通过上调菠菜水通道蛋白基因的表达，从而提高种子的吸水能力，促进种子发芽（图12）。另外由于CDs自身的特定结构（—OH和—CO等表面官能团）使其可以作为优良的土壤保湿剂，保证种子发芽所需要的湿度，进而促进种子发芽（图12）。

3 讨论与结论

基于ENMs，发展新型的纳米农业技术及产品（纳米肥料和纳米农药）能够减少现有农业化学品投入，降低农业生产对环境的影响。同时，纳米农业技术有效地保持/提高农作物的产量，利于保证全球粮食安全，降低人口快速增加对粮食需求的压力[19]。截至目前，基于金属和金属氧化物的纳米农业技术得到快速发展。例如，氧化铜纳米片（50 mg/L）可以提高大豆地上生物量（60.3%）和地下生物量（34.3%）[20];3% Fe2O3 ENMs提高了36.5% 的生菜幼苗干重[21]。然而，金属和金属氧化物在农业中不适当或过量使用，使得这些纳米肥料会通过许多途径进入土壤，进行植物积累，最终进入食物链，对人体造成危害[22]。

相比之下，CDs ENMs具有生物相容性、化学惰性，甚至对食物链和人体细胞无毒。近年来的研究表明，CDs可以作为光转换材料，提高作物对光的捕获能力，从而增强其光合作用，提高作物产量。例如，烟草叶片在注射CDs 溶液2 d后，其光合速率提升了18.0%[23];CDs（560 mg/L）可以增强光合中Rubisco活性（42.0%），并使双子叶谷物（大豆、番茄和茄子）的产量提高20.0%[24]。该研究结果表明，由一步水热法合成的粒径小于10 nm的CDs ENMs自身独特的亲水结构以及上调种子水通道蛋白表达，可以增强种子吸水能力，从而能够促进作物种子的发芽和生长，这为后期的作物生长及产量提供了重要的保障。除此之外，不同CDs均对种子萌发有显著的促进作用，同时CDs具有低毒性、来源广泛、成本低的特点，使其在纳米农业发展上有广阔应用前景。因此，基于CDs ENMs的纳米农业技术有望应用在可持续农业生产中。然而，目前CDs ENMs的大规模合成的局限性和高成本阻碍了其在农业生产中的应用。农业生产过程中的废弃生物质提供了多种廉价的前体物质，开发生物质资源化利用技术，能够实现生物质CDs ENMs的大量、廉价制备。因此，生物质CDs ENMs在未来的农业中具有巨大的潜力。

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