浅谈冷冻切片中冰晶的形成和解决方法

范冬梅，许宏烽，沈溪明

(中山大学孙逸仙纪念医院病理科，广东 广州 510000)

0 引言

冷冻切片，是通过各种方法使组织快速降温后，冷冻成具有一定硬度，切出薄片在显微镜下进行观察得出病理诊断结果[1]。术中冷冻切片，可为临床医生提供病理诊断结果以决定手术方式，因此高质量的冷冻切片为病理报告的准确性提供可靠的依据，而低质量的冷冻切片往往会给病理医生造成诊断困难，甚至会引起误诊[2-4]。冷冻切片中冰晶形成，是冷冻切片最难避免、也是最容易影响诊断的问题之一。冷冻组织迅速玻璃化对减少冷冻切片中冰晶的形成至关重要，冰晶的形成一般在切片的空白区，会导致细胞内空泡增多。镜下显示：组织挤压、形态难辨，其间夹杂有大小、形态不一的空隙，给诊断造成困难[5]。如何减少术中冷冻切片冰晶的形成，一直以来都是病理技术员需要克服的一个技术难题。本文根据我们的经验，分享一些减少冰晶形成的解决方法，来提高冷冻切片质量，以期为病理医师精确诊断和临床医生选择手术方案提供可靠保证。

1 材料和方法

1.1 标本

选取我院病理科2020年11月至2020年12月间符合冷冻切片标准的新鲜组织(包括肝、肾、乳腺等组织)。

1.2 器械设备

LEICA CM1950 冷冻切片机、OCT包埋剂、样本托、冷冻锤、一次性刀片、毛笔、载玻片、NQ100冷冻染色机，显微镜。

1.3 方法

分别从组织取材厚度、有无吸干组织水分、加入OCT包埋剂的量、组织冷冻方式、组织粗修深度和复温等多个因素进行实验，镜下观察切片中冰晶形成情况。

1.3.1 组织取材厚度

将新鲜组织标本均以1.5cm×1.5cm取材，取材厚度分别为0.3cm和0.5cm(用滤纸吸干组织表面水分)，冷冻切片机机箱温度设置在-20℃～-15℃，将两组组织放在加了包埋剂的样本托上，再用冷冻锤速冻压平，取下托盘架固定到冷冻切片机的冷冻头上开始切片，用3%乙醇冰醋酸固定液进行固定，之后放在NQ100冷冻染色机上进行常规HE染色，最后中性树胶封片。

1.3.2 有无对组织水分进行吸干

将新鲜组织标本均以1.5cm×1.5cm取材，取材厚度均为0.3cm，一组对组织表面水分使用滤纸吸干，另一组不进行处理，将两组组织放在加了包埋剂的样本托上，再用冷冻锤速冻压平，取下托盘架固定到冷冻切片机的冷冻头上开始切片，用3%乙醇冰醋酸固定液进行固定，之后放在NQ100冷冻染色机上进行常规HE染色，最后中性树胶封片。

1.3.3 加入OCT包埋剂的量

将新鲜组织标本均以1.5cm×1.5cm取材，取材厚度均为0.3cm(用滤纸吸干组织表面水分)，一组在组织包埋时加入适量的OCT包埋剂在其表面，可明显看到冷冻组织，另一组则加入过量的OCT包埋剂，使其覆盖充满组织表面，无法看清组织，再用冷冻锤速冻压平，取下托盘架固定到冷冻切片机的冷冻头上开始切片，用3%乙醇冰醋酸固定液进行固定，之后放在NQ100冷冻染色机上进行常规HE染色，最后中性树胶封片。

1.3.4 组织冷冻速度

将新鲜组织标本均以1.5cm×1.5cm取材，取材厚度均为0.3cm(用滤纸吸干组织表面水分)，将两组组织放在加了包埋剂的样本托上，一组使用冷冻锤对组织进行速冻压平，另一组不使用冷冻锤，使其自然冷冻，取下托盘架固定到冷冻切片机的冷冻头上开始切片，用3%乙醇冰醋酸固定液进行固定，之后放在NQ100冷冻染色机上进行常规HE染色，最后中性树胶封片。

1.3.5 组织粗修深度

将新鲜组织标本均以1.5cm×1.5cm取材，取材厚度均为0.3cm(用滤纸吸干组织表面水分)，将组织放在加了包埋剂的样本托上，再用冷冻锤速冻，取下托盘架固定到冷冻切片机的冷冻头上开始切片，选取表面和不同粗修深度的组织切片，用3%乙醇冰醋酸固定液进行固定，之后放在NQ100冷冻染色机上进行常规HE染色，最后中性树胶封片。

1.3.6 复温

将新鲜组织标本均以1.5cm×1.5cm取材，取材厚度均为0.3cm(用滤纸吸干组织表面水分)，将组织放在加了包埋剂的样本托上，再用冷冻锤速冻，选取用手捂(手指轻轻覆盖1-2秒)组织升温和不进行升温的组织切片，用3%乙醇冰醋酸固定液进行固定，之后放在NQ100冷冻染色机上进行常规HE染色，最后中性树胶封片。

1.4 结果观察

由两名主治以上医师进行双盲阅片，镜下观察，观察整张切片中有无冰晶形成的区域及冰晶形成的位置。

2 结果

当取材厚度为0.3cm，用滤纸吸干组织表面水分，加入适量的OCT包埋剂，用冷冻锤加速冷冻组织和选取表面组织切片时，镜下观察组织结构清晰，形态基本完整，薄厚均匀，红蓝对比鲜明，透明度较好，极少有冰晶形成，当取材厚度为0.5cm、过量的OCT包埋剂、不使用冷冻锤速冻组织和粗修过深都会影响冰晶的形成，导致组织切片中出现空洞及轻微裂隙，使镜下观察时组织形态变形，难以辨认(如图1、图2和图3)。当组织质地较脆时，选择适宜的温度或粗修之后用手捂组织稍复温后进行切片，组织结构清晰，形态基本完整，薄厚均匀，红蓝对比鲜明，透明度较好，若未使用复温方式切片会影响切片质量(如图4)，但组织中水分冻融后二次结晶，会容易形成大量不规则分布在细胞质内和核内的冰晶(如图2和图3)。

3 讨论

新鲜组织不经任何固定脱水等处理，直接在低温恒冷切片机冷冻后马上进行切片，称为冷冻切片。冷冻组织制片的原理是利用物理降温的方法，借助冷冻切片机的低温来迅速冷冻组织，使组织在短时间变硬，以用于制备冷冻切片[4]。目前，手术中需要病理诊断的手术病例逐年增多，临床手术医生对术中病理报告的依赖性也有所增加，所以冷冻切片的质量是手术中病理诊断的重要保证。理想的切片应做到切片完整、较薄和均匀、无皱折、无刀痕、贴片恰当。冷冻切片时每个操作都能影响冰晶的形成，从而影响制片质量及病理诊断。如何制作出一张能符合诊断要求的高质量冷冻切片，需要病理技术员有丰富的切片经验和技术以及把控切片制作全过程。

水冷冻凝结成为固态有两种主要形式：晶体态(结晶成核转变为规整排列固体的形式)和玻璃态(无序固体的形式)。玻璃化是指水转化为非晶体(玻璃态)的固化过程，其本质是冷冻固化温度降得足够快时，水不经历结晶过程而直接变成过冷液体，最终形成玻璃态。冷冻组织迅速玻璃化对保证冷冻切片组织形态至关重要[5,6]。

在实际的冷冻切片制片工作中，导致冷冻组织冰晶形成的因素有多种，不同的因素均可不同程度地导致冰晶的形成，在组织进行冷冻的过程中，如果缓慢冷冻，组织中的水分会逐渐聚集形成冰晶的晶核，并与周围的水分子继续凝结，形成更大的水分子，一旦冰晶形成，便会对周围的组织细胞进行挤压、破坏，导致组织细胞形态破坏[7,8]。冷冻切片中常见的冰晶为细胞外冰晶和细胞内冰晶，细胞外冰晶出现在细胞外，形态表现为不规则透明间隙，同时出现细胞收缩，组织形态结构变形，细胞的收缩导致冷冻切片染色不佳。细胞内冰晶出现在细胞内，以出现的的部位不同，可以分为胞质内冰晶和胞核内冰晶，细胞内冰晶的形成，一般仅仅对细胞的局部结构造成挤压，细胞局部形态收到影响，但整个细胞不出现明显收缩，组织的形态结构不出现明显变形。在生物体内，细胞中水中占80%～90%，水在各种组织中含量最多，我们对组织中的水分进行吸干，可以减少组织中的水分含量，进而减少冰晶的形成，由于我们日常使用的冷冻样本托较小，含有的致冷能量较少，使用冷冻锤致冷时，可以使组织温度迅速降低，加快组织冷冻速率，此外，组织厚度较薄以及适量的包埋剂均可使组织温度迅速降低，抑制晶核的形成，减少冰晶的形成，对于同一冷冻组织，在组织进行速冻时，表层的组织迅速降低，先冷冻凝固，内层组织温度逐渐降低，导致组织表面与内层在冷冻速度上存在差异，使得内部组织有时间形成晶核，进而形成冰晶，导致组织内部存在冰晶，在镜检组织切片时，可以看到细胞之间以及细胞内部存在空洞，破坏了组织细胞的形态结构。因此，对冷冻组织取材厚度适中，对组织表面的体液或水分进行吸干处理，加入适量的冷冻包埋剂，并利用冷冻锤对组织进行压平、速冻后，尽可能切全后切取表层组织，选择合适的温度和复温进行染色制片所制得的切片效果最佳，避免对组织进行粗修、深切，既可减少组织切片中的冰晶影响，又可减少组织损耗，特别是对于肿瘤病灶较小的组织，可以尽可能保留病变组织用于冷冻后石蜡切片的常规HE染色及免疫组化染色诊断。