苦参碱诱导肿瘤细胞凋亡的研究进展

刘悦

(陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046）

关键字：周期阻滞；凋亡通路；内质网应激；端粒酶

0 引言

细胞凋亡是在一些生理或者轻微病理因素刺激下，活体组织中的单个细胞主动死亡的过程。表现为细胞固缩，染色质边集，细胞膜可出芽形成凋亡小体，凋亡小体被吞噬细胞或其他细胞吞噬[1]。现在研究表明，恶性肿瘤的产生与凋亡异常密切相关，一旦细胞周期监控失控，DNA受损的细胞将不能正常修复和凋亡，将继续分裂，结果基因突变数量增加，往往导致细胞发生癌变[2]。目前很多化疗药物都是通过诱导凋亡抗肿瘤的，如依赖P53，Fas/FasL,Bcl-2介导的细胞凋亡[3]。苦参碱是中药苦参的提取物，属于生物碱类，近年来作为抗肿瘤药受到广泛关注，对肝癌，肺癌，乳腺癌等恶性肿瘤都有一定的抑制作用，主要通过诱导细胞凋亡发挥作用的。BH3-only蛋白模拟物，Bcl-2拮抗剂，bax激活剂这些合成的单靶点药物，虽然能明显调控某个蛋白表达，但是临床试验却效果不佳，提示细胞有自身代偿。而中国特有的中医药或者它的单体是多靶点的，多方面的，或许可以更好的应用于临床。苦参碱可以通过诱导周期阻滞，调控信号通路，抑制端粒酶促进凋亡，还可以通过调控免疫反应，抑制肿瘤迁徙和转移，抑制肿瘤血管生成发挥作用。

1 周期阻滞与细胞凋亡

细胞周期会受到严密的调控来保障细胞正常的分裂增殖，p53/p21信号通路是细胞核心调控途径，p53调控p21表达，P21通过结合抑制CDK2（细胞周期素依赖性激酶）/CyclinE(细胞周期蛋白)和CDK4/CyclinD复合物,阻断RB(视网膜母细胞瘤相关基因)基因磷酸化，去磷酸化的RB与E2F结合，使E2F无法调控下游基因表达[4]，细胞G1期阻滞。P53也可以诱导G2期阻滞，但不是必需的。细胞周期阻滞会使细胞修复，修复失败就会导致细胞凋亡。很多恶性肿瘤都会出现P53突变，恢复P53的活性，成为肿瘤治疗的热门之一。马建秀等[5]通过研究苦参碱联合奥利沙铂对结肠癌SW620作用时发现苦参碱可以诱导细胞凋亡，使细胞阻滞于G2/M期，而且具有增强奥利沙铂诱导P53表达增加的作用。李磊等[6]通过研究氧化苦参碱对胃癌SGC-7901作用时发现氧化苦参碱可以使细胞P21表达增加，随着时间越长，P21表达越明显。而且氧化苦参碱可以使细胞阻滞于G0/G1期，随着药物浓度增加对G0/G1阻滞作用更强。肖旭等[7]在研究苦参碱对乳腺癌Bcap-37作用时发现苦参碱可以上调P53下调CyclinD1,C-myc蛋白表达，CyclinD1是P53下游基因，CyclinD1和C-myc主要调控G1/S期，说明苦参碱通过下调CyclinD1,C-myc蛋白影响G1期向S期转换。耿娅等[8]发现低浓度苦参碱诱导肝细胞L-02阻滞G0/G1期，而高浓度苦参碱使细胞G2/M期阻滞，S期延长。苦参碱对细胞周期的调控，主要通过一些关键蛋白实现的，这些蛋白既可以作用于下游的周期蛋白影响细胞周期转换，从而诱导周期阻滞，又可以作用于凋亡通路蛋白，使细胞发生凋亡。苦参碱把肿瘤细胞阻滞于哪一期，跟肿瘤细胞的类别和苦参碱的浓度有关。

2 凋亡通路与凋亡

凋亡通路分为内源性线粒体通路，死亡受体通路和内源性内质网应激通路，其中线粒体通路是中心调控阶段。Bcl-2家族凋亡中抑制凋亡的蛋白如Bcl-2，Bcl-xl，Bcl-W等，促进凋亡的蛋白如Bax，Bak，BH3-only蛋白(Bid,Bad,Bim)也属于促凋亡蛋白[9]。

2.1 线粒体凋亡通路与凋亡

线粒体凋亡通路是细胞凋亡最经典的途径，在内源性损伤因素（如药物干扰下，激素缺乏），BH3-only蛋白激活增多，使bax变构定位于MOM(线粒体外膜)上，BH3-only蛋白不以这样方式作用于bak，因为bak直接定位于MOM上，BH3-only蛋白也可以使定位在MOM上的bax/bak暴露出BH3位点，形成bax/bak二聚体，寡聚体[10]，孔道开放，线粒体膜间隙中的Cytc进入胞浆与Apaf-1（凋亡蛋白酶活化因子），Pro-caspase-9，ATP结合，形成凋亡复合体，自我剪切激活Pro-caspase-9形成caspase-9，caspase-9剪切激活下游caspase-3，激活的caspase-3激活下游蛋白，诱导细胞凋亡[11]。

人类许多肿瘤都存在抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的过度表达，使肿瘤细胞生长加速，不易凋亡，最后恶性程度增加。抗凋亡蛋白可以使bax从MOM转移到细胞质中，避免bax在MOM寡聚，有人认为是Bcl-xL通过Bax的持续转移维持细胞质中的Bax[12]。抗凋亡蛋白增多还可以与促凋亡蛋白如形成Bax/Bcl-2异源二聚体，抑制bak/bax同源二聚体形成来抑制凋亡。抗凋亡蛋白增多可能与BH3-only蛋白结合，阻止BH3-only蛋白对bax/bak的激活[13]BH3-only蛋白模拟物作为新型抗肿瘤药物，与肿瘤细胞过表达的Bcl-2蛋白结合，来阻止Bcl-2蛋白与bax/bak结合，促进肿瘤细胞凋亡。既往研究表明，苦参碱可以通过调节凋亡蛋白来诱导肿瘤细胞凋亡。刘桐等[14]在研究苦参碱对人结肠癌HT-29细胞凋亡作用时发现苦参碱可以使细胞Bax表达升高，Bcl-2表达降低。程向东等[15]在研究苦参碱对肝癌Hep G2细胞凋亡作用中发现苦参碱可以降低Bcl-2蛋白的表达，提高Bax蛋白的表达，而且可以促进Bax从胞浆向线粒体移位，降解激活caspase-3，9蛋白说明苦参碱有可能通过激活内源性线粒体通路促进肿瘤细胞凋亡。

2.2 Fas/FasL通路与凋亡

在外源性通路中，最经典的是Fas/FasL通路，Fas/FasL结合导致Fas胞内部形成活化三聚体，随后募集FADD（Fas相关死亡结构域蛋白）与Pro-caspase-8形成DISC（死亡诱导信号复合体）。Pro-caspase-8自我剪切被激活形成caspase-8，caspase-8不但可以剪切激活caspase-3,6,7，而且可以启动线粒体凋亡途径[16]。黄光弦等[17]在研究苦参碱对小鼠S180肉瘤细胞凋亡作用时发现苦参碱可以上调瘤体组织Fas/FasL表达，增加caspase-8的表达和活性，说明苦参碱可能通过启动Fas/FasL通路促进凋亡。

2.3 内质网应激通路与凋亡

内质网腔出现未折叠蛋白或错误折叠蛋白积聚或者滞留时，如损伤因素刺激或者泛素蛋白酶体被抑制，会触发内质网应激和未折叠蛋白反应，内质网发生应激时Bip与PERK解离，PERK自身活化使eIF-2磷酸化，增加ATF4的表达，ATF4通过上调CHOP诱导细胞凋亡[18]。目前蛋白酶体抑制剂可能通过激活内质网应激促进肿瘤细胞凋亡。Junli[19]等在研究苦参碱通过激活（未折叠蛋白反应/内质网应激通路）UPR/ER抑制前列腺癌中发现苦参碱可以抑制蛋白酶体，使前列腺癌Bip表达增加，eIF2a磷酸化增加，CHOP和ATF4表达增加，而且可以抑制Bcl-2蛋白促进Bax蛋白表达，使肿瘤细胞凋亡，说明苦参碱很有可能通过激活UPR/ER通路促凋亡的。苦参碱还可以时间依赖性抑制CyclinD1，CyclinB1，C-myc，CDK1的表达，导致G0/G1期发生周期阻滞，也有可能通过激活UPR/ER通路实现的。曹珊等[20]在研究苦参素对食管癌Eca-109细胞凋亡作用时发现苦参素可以上调CHOPmRNA,下调BIPmRNA，说明苦参素可能通过激活内质网应激凋亡通路，通过上调CHOP诱导细胞凋亡。

细胞凋亡通路是由很多蛋白质参与的网络系统，这些蛋白质的表达处在一种动态平衡中，随着细胞内外信号的变化而变化，当发生肿瘤时，这些蛋白表达会失衡，比如抗凋亡蛋白表达增加，这些蛋白作用下游蛋白产生级联放大反应有可能会促进肿瘤细胞分裂增殖。调控这些蛋白的表达也许可以抑制增殖或者诱导凋亡，从而治疗肿瘤，但是这些蛋白作用机制过于复杂，针对某种蛋白的靶向药有可能通过旁路代偿，并没有很好的效果，所以寻找合适的靶点至关重要。中医药或者它的单体是多靶点的，或许可以通过研究苦参碱作用机制寻找敏感的新靶点，或者寻找某些有效的中药单体或者单体联合靶向药可以达到治疗肿瘤的效果。

3 端粒酶与凋亡

端粒位于真核细胞染色体末端，由高度重复的DNA序列和端粒结合蛋白组成的，类似帽子结构，具有保护DNA不被降解的功能。染色体每复制一次，端粒缩短一截，一旦端粒过短，持续的DNA损伤应答就会造成p53信号通路被激活，细胞停止分裂或者启动凋亡。端粒酶由RNA和蛋白质组成的逆转录酶，可以使端粒不会随着分裂而变短。正常人体细胞几乎检测不到端粒酶活性，所以端粒会随着分裂变短，大部分肿瘤细胞端粒比正常细胞短，端粒酶活性却增强，这与肿瘤细胞不衰老，无限增殖有关，提示人们可以通过抑制端粒酶活性而抑制端粒延长达到抗肿瘤的效果[21]。现在这类靶向分子药很难应用于临床，因为对人体有很大不良反应，在作用用于肿瘤的同时也会作用于一些端粒酶活性高的细胞，比如说成体干细胞，苦参碱具有副作用小的优点。张璐烨[22]等研究表明苦参碱可以诱导RB（视网膜母细胞瘤）细胞凋亡，而且可以减弱RB细胞端粒酶活性。李海军[23]等研究表明苦参碱对人乳腺癌MCF-7有明显的促凋亡作用，而且端粒酶的活性随苦参碱的浓度和作用时间增加而下降。说明苦参碱有可能通过抑制端粒酶的活性来发挥促进凋亡作用的。

4 结语

苦参碱作用机制极其复杂，诱导不同肿瘤细胞凋亡的主要激活通路也不都相同，本文主要从三个方面介绍苦参碱对肿瘤细胞的凋亡诱导作用，在此基础上研究苦参碱的其他作用机制，开发其他药用价值，或者与一些分子靶向药联合应用，将为临床疑难杂症的治疗打开新天地。