胰腺癌免疫抑制性肿瘤微环境研究综述

李静威，王俐文，蒋玲曦，詹 茜，陈 皓，沈柏用

上海交通大学医学院附属瑞金医院普外科胰腺疾病诊疗中心，上海交通大学医学院胰腺疾病研究所，上海 200025

胰腺癌是一种恶性程度较高的肿瘤，早期诊断较为困难。传统的手术治疗、放射治疗（放疗）、化学治疗（化疗）对于胰腺癌的效果有限，缺乏有效的治疗手段导致胰腺癌的预后极差。近年来，免疫治疗逐渐应用于多种类型肿瘤的治疗，然而其应用于胰腺癌的临床试验却没有达到预期的疗效［1］。免疫治疗失败的主要原因之一是胰腺癌的肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）具有免疫抑制性。对于胰腺癌免疫抑制性TME的组成成分以及各自的功能，研究者进行了细致且深入的探索，这些成果将为胰腺癌免疫治疗的开展提供新的思路。

1胰腺癌的TME

由于胰腺癌患者在疾病早期缺乏特异性的临床表现，早期诊断相当困难，大部分患者确诊时已到中晚期，已不再具备手术切除的条件。由于缺乏有效的治疗手段，胰腺癌发展迅速，易复发或转移，预后极差。全球胰腺癌患者总体5年生存率<6%，行根治性手术后的患者5年生存率<25%［2-3］。导致这一现象的主要因素之一是其TME间质含量丰富［4］。大量的间质成分一方面使得药物难以渗透至肿瘤内部，另一方面塑造了免疫抑制的TME。

TME是肿瘤组织的重要组成部分，包含肿瘤细胞、免疫细胞、基质细胞、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）及多种可溶性分子，在肿瘤的发生和发展过程中起到重要作用［5］。胰腺癌TME中，肿瘤细胞仅占一小部分，其余大部分由基质成分构成，其中包含多种免疫抑制性细胞，如髓系来源抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）、肿瘤相关巨噬细胞（tumorassociated macrophages，TAMs）、调 节 性T细 胞（regulatory T cells，Treg）、胰腺星状细胞（pancreatic stellate cells，PSCs）和肿瘤相关成纤维细胞（cancerassociated fribroblasts，CAFs）等，而抗肿瘤免疫细胞如自然杀伤（natural killer，NK）细胞和CD8+T细胞等则浸润较少［6］。因而，胰腺癌TME表现为高度免疫抑制性，同时丰富紧密的ECM及可溶性分子对于抑制抗肿瘤免疫也发挥重要作用。

胰腺癌肿瘤细胞主要通过2种途径与TME中的其他细胞相互作用：接触依赖性机制是指细胞与细胞的直接接触或者细胞与ECM的直接接触引起的相互作用；非接触依赖性机制是通过分泌可溶性分子进而影响其他成分。胰腺癌细胞不仅能够募集各种免疫抑制性细胞，也能通过表达和分泌免疫抑制性分子促使肿瘤局部的具有抗肿瘤功能的炎症细胞再极化为免疫抑制性细胞，促进免疫抑制性TME的形成，从而保护胰腺肿瘤免受免疫监视，减少抗肿瘤免疫应答，并“驯化”机体免疫系统使其促进肿瘤生长、侵袭、转移［7］。

胰腺癌的进展能够影响TME中的成分。在正常胰腺组织存在部分免疫细胞的浸润，而CAFs稀少。在胰腺炎和胰腺上皮内瘤变组织中，中性粒细胞和M1型巨噬细胞高度浸润，其余的免疫细胞则呈现低度浸润状态。而单细胞测序分析结果显示在胰腺癌组织中，分选出的大部分细胞为免疫细胞，其中髓系细胞（包括MDSCs、TAMs等）占36.7%，T细胞和NK细胞占30.5%，CAFs占6.2%；TME中含量丰富的M2型TAMs、MDSCs、Treg、Th2型T细胞均提示胰腺癌的不良预后［6，8］。

胰腺癌的TME可以影响传统的化疗效果。胰腺癌的TME与多种化疗方法的耐药性有关，这种现象称为环境介导的耐药性［9］。TME中致密的ECM能够压缩肿瘤组织中的血管，影响化疗药物的进入和分布；而CAFs、中性粒细胞的浸润情况也与胰腺癌的耐药性呈正相关，如CAFs可以通过SDF1A/CXCR4和mTOR/4E-BP1等途径诱导肿瘤细胞的耐药性［10-11］。针对胰腺癌的化疗也可以对TME的成分进行重塑。与没有接受化疗的胰腺癌患者以及健康人相比，化疗后的胰腺癌患者中促MDSCs型细胞分子的含量升高，提示肿瘤组织对MDSCs的招募增强。在小鼠胰腺癌模型中，吉西他滨在杀伤肿瘤细胞的同时，也会诱导肿瘤细胞分泌Th2型细胞因子，促进TAMs极化为M2型，并诱导肿瘤细胞分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage-colony stimutaing factor，GM-CSF）招募MDSCs，MDSCs和M2型TAMs则可以限制吉西他滨的疗效［12］。

肿瘤的免疫治疗在近几年有重大进展。胰腺癌TME中的具有免疫抑制作用的细胞和分子为免疫治疗提供了可能的靶点［13］。

2 TME中各种免疫抑制性细胞

2.1 CAFs和PSCs

2.1.1 CAFs CAFs被定义为肿瘤组织中一群成纤维性、非增生性、非血管性、非内皮性和非免疫性细胞，来源广泛，包括静止的PSCs、静止的成纤维细胞、内皮细胞，脂肪细胞、骨髓来源的间质细胞等；常用的细胞标志物为成纤维特异性蛋白1和α平滑肌蛋白等［11］。静止的成纤维细胞在生理状态下位于胰腺结缔组织中，能够产生生理性的ECM。在肿瘤发生早期，肿瘤细胞分泌的细胞因子如转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、音猬蛋白（sonic hedgehog，SHH）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等能够诱导成纤维细胞的浸润和激活。当CAFs被激活后，一方面通过分泌小分子如血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）和基质细胞衍生分子-1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）等促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移，另一方面产生过量的基质成分如胶原蛋白，形成基质屏障，阻止抗肿瘤药物和免疫细胞进入肿瘤组织发挥作用，从而形成促肿瘤的TME［13］。

近期研究表明，CAFs对于胰腺癌免疫抑制性TME的形成有着重要作用。CAFs通过分泌CXCL12吸引CXCR4+T细胞，使其迁移至远离肿瘤细胞的基质成分中，同时分泌CCL5、CCL2和CCL17募集单核细胞和Treg，促进局部免疫抑制性微环境的形成［13］。在小鼠胰腺癌模型中清除CAFs后，可以增强细胞毒性T细胞的抗肿瘤能力，改善免疫治疗的效果，表明CAFs及其分泌的细胞因子是抑制胰腺癌抗肿瘤免疫应答的重要因素［14］。此外，Hartmann等［15］通过体外实验发现，肿瘤组织CAFs分泌的胶原蛋白可以通过接触性机制引导T细胞的迁移，密度增加的胶原蛋白网络可以形成一种物理屏障阻断活化T细胞的进入，抑制T细胞介导的抗肿瘤免疫。CAFs同样可以直接接触T细胞而抑制其功能。有研究［8］在KPC小鼠（一种胰腺癌转基因小鼠）的胰腺癌组织中发现CAFs的一个亚群apCAF，能够表达主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）-Ⅱ类分子，但不表达共刺激受体，造成CD4+T细胞失活或转化为Treg。尽管CAFs发挥免疫抑制作用，但如果仅清除α平滑肌蛋白阳性的细胞，将会促进小鼠胰腺癌的发展和侵袭，使小鼠成活率降低，可能的原因是紧密的基质成分同样可以抑制肿瘤细胞向外侵袭［16］。因而，靶向CAFs的治疗仍需要进一步探索。

2.1.2 PSCs PSCs是胰腺组织中的一种成纤维样细胞，能够分泌ECM成分和多种细胞因子，是胰腺癌患者CAFs的重要来源之一［17］。在胰腺生理组织中，PSCs数量稀少，主要位于胰腺腺泡旁。当发生胰腺肿瘤时，静止的PSCs可以被细胞因子如白介素（interleukin，IL）-1、IL-6、TGF-β等激活，进而分泌许多可溶性细胞因子如TGF-β、IL-10、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1），与肿瘤组织中的免疫细胞相互作用，导致免疫抑制性细胞的增多；同时能够减少抗肿瘤免疫细胞的浸润，进而促进免疫抑制性TME的形成［18］。PSCs可以分泌IL-6，促进MDSCs的分化和迁移；同时PSCs来源的CXCL12可以募集MDSCs至肿瘤部位［19］。此外，IL-6和CXCL12也可以促进Treg在TME的浸润。PSCs也可以分泌半乳凝集素-1，一方面促进胰腺癌组织中CD4+和CD8+T细胞的凋亡，另一方面促进Th2型细胞因子如IL-4和IL-5的分泌，减少Th1型细胞因子如IL-2和γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）的分泌［12，20］。而PSCs来源的IL-10则可以诱导巨噬细胞向M2型分化，其分泌的VEGF可以促进M2型巨噬细胞在肿瘤组织中的浸润［21］。在小鼠胰腺癌模型中，通过抑制PSCs分泌基质，使其恢复静息状态，能够增加化疗药物在TME中的转运效率，提高胰腺癌的化疗效果［22］。

2.2 MDSCs

MDSCs是一类髓系来源的未成熟的具有免疫抑制功能的细胞群，根据表型和功能不同可以分为粒系MDSCs和单核系MDSCs［23］。在正常的胰腺组织中难以发现MDSCs的存在。在炎症、创伤、肿瘤等病理情况下，位于骨髓的原始细胞分化受阻形成MDSCs［24］。在胰腺上皮内瘤变和慢性胰腺炎等状态中，胰腺周围及脾脏中浸润的MDSCs数量显著增多［25］。在胰腺癌患者尤其是进展期患者中，肿瘤组织中的肿瘤细胞和炎症细胞能够募集并激活以粒系为主的MDSCs，导致骨髓、外周血以及TME中的MDSCs的数量明显增多［26-27］。MDSCs的免疫抑制功能由以下多种途径介导。①产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）自由基抑制免疫。肿瘤细胞可以通过分泌细胞因子如TGF-β、IL-10、IL-6等诱导MDSCs生成ROS，同时T细胞与MDSCs的接触也会增加ROS的产生，增多的ROS可以诱导TME中免疫细胞的氧化应激，影响其抗肿瘤能力［28］。②高表达精氨酸酶和一氧化氮合成诱导酶，抑制T细胞增殖并促使其凋亡。精氨酸酶消耗了环境中的非必需氨基酸，通过降低CD3和CDK4等表达导致T细胞的增殖受阻；增多的一氧化氮可以通过抑制JAK3和STAT5信号通路，减少MHC-Ⅱ类分子表达等方式影响T细胞功能，并诱导其凋亡［28］。③产生过氧亚硝酸盐诱导T细胞无能。MDSCs通过与T细胞接触能够产生过氧亚硝酸盐，导致TCR和CD8分子硝化，使其对特定肿瘤抗原失去特异性识别和结合的能力［28］。④诱导Treg分化。在IFN-γ诱导下，MDSCs可以分泌IL-10、TGF-β诱导Treg的分化［29］。⑤增加程序性死亡受体-配体1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）的表达。活化的T细胞和MDSCs接触后分泌IL-10，导致MDSCs的STAT3磷酸化，进而促进PD-L1分子的表达，抑制T细胞功能。⑥降低L-选择素的表达，影响T细胞归巢功能。MDSCs可以下调T细胞表面的L-选择素，影响其归巢和趋化能力，抑制其激活。Porembka等［26］发现减少小鼠胰腺癌的TME中MDSCs的数量可以促进T细胞浸润于TME、抑制肿瘤生长、延长中位生存时间，认为MDSCs可以作为胰腺癌免疫治疗的潜在靶点。

2.3 TAMs

巨噬细胞是肿瘤组织中免疫浸润的重要组成成分，在机体的天然免疫反应中有重要作用。根据诱导条件的不同，巨噬细胞可以极化为经典激活的M1型巨噬细胞和替代激活的M2型巨噬细胞。在肿瘤组织中浸润的巨噬细胞称为TAMs，大部分通过肿瘤细胞和基质细胞产生的细胞因子和趋化因子从外周血募集并完成极化，在进展期肿瘤中主要表现为M2型巨噬细胞表型［30］。在胰腺癌组织中，可以观察到数量丰富的M2型TAMs，其数量与肿瘤的TNM分期相关，可用于评估患者预后和肿瘤的进展情况［31］。TAMs可以通过多种方式增强TME的免疫抑制性。在小鼠的肝细胞癌模型中，TAMs可以自分泌TNF-α和IL-10进而促进PD-L1的高表达，从而抑制抗肿瘤T细胞的功能［32］。在小鼠恶性胸腔积液模型中，TAMs来源的TGF-β一方面可以促使TAMs自身分泌CCL22进而募集Treg浸润于TME中，后者可以分泌IL-8进一步促使TAMs分泌TGF-β，进而增强TME的免疫抑制性；另一方面TGF-β可以促进CD8+T细胞表面程序性死亡受体-1（programmed cell death protein-1，PD-1）、细胞毒T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）等抑制性分子的表达，减少颗粒酶和IFN-γ的产生，抑制其抗肿瘤能力［33-34］。此外，TAMs还可以分泌CCL17、CCL18等趋化因子募集Treg，同时分泌前列腺素E2、IL-10等诱导Treg的分化，进而促进TME中的免疫抑制［30］。Zhang等［35］发现，在体外实验中TAMs可以通过表皮生长因子受体/丝裂原活化蛋白激酶途径上调胰腺癌肿瘤细胞表面B7-H4分子的表达，减弱T细胞杀伤效应。胰腺癌TME中的TAMs可以作为免疫治疗的潜在靶点。Kaneda等［36］发现，在小鼠胰腺癌模型中，抑制PI3Kγ能够抑制M2型TAMs的极化，恢复T细胞的抗肿瘤功能，提高胰腺癌小鼠模型对于化疗的反应性。

2.4 Treg

Treg被定义为一群CD3+CD8+Foxp3+的T细胞，在生理状态下发挥免疫调节、诱导免疫耐受等作用。在机体发生肿瘤等病理情况时，Treg发挥的作用较为复杂。正常胰腺组织中Treg含量极少，而在胰腺癌癌前病变和胰腺癌组织中均能发现Treg。胰腺癌患者外周血Treg细胞数量与胰腺癌的分期密切相关，可以作为评估胰腺癌预后和疗效的指标［37］。肿瘤组织可以通过多种方式增加TME中Treg的浸润：肿瘤细胞来源的多种趋化因子如CCL5、CCL17、CCL22能够募集Treg，TME中的血管内皮细胞能够促进Treg的黏附和聚集，TME中的其他免疫抑制细胞可以分泌TGF-β诱导CD4+T细胞向Treg转化［38］。Treg在胰腺癌TME中主要发挥抑制抗肿瘤免疫反应的作用。Treg能够高表达CTLA-4、PD-1等免疫抑制性分子，通过细胞间接触抑制T细胞的作用，并且可以释放颗粒酶和穿孔素直接诱导CD8+T细胞死亡［39］。Treg与TME中的抗原提呈细胞相互接触后，能够下调其表面的CD80/CD86分子的表达，间接增加CD8+T表面PD-1和T细胞免疫球蛋白黏蛋白3（T-cell immunoglobulin mucin 3，TIM-3）等抑制性受体的表达，减少细胞因子和颗粒酶的释放，降低其杀伤肿瘤细胞的能力并促进其凋亡［40-41］；Treg也可以通过细胞接触和分泌IL-10、TGF-β抑制NK细胞、自然杀伤T（natural killer T，NKT）细胞以及CD8+T细胞的功能［42］。研究人员在针对Treg的免疫治疗上做出了许多尝试，Treg抑制剂和其他药物的联合治疗方案在动物模型上已有一定的成效。Soares等［43］发现在小鼠胰腺癌模型中，联合使用TGF-β阻断抗体和GMCSF基因修饰的肿瘤疫苗GVAX可以减少TME中Treg的浸润，显著增加抗肿瘤特异性CD8+T细胞浸润，并增加IFN-γ的分泌，延长胰腺癌小鼠的生存时间。利用靶向Treg的CD25单克隆抗体、糖皮质激素诱发型肿瘤坏死因子受体抗体均能减少小鼠胰腺癌TME中Treg的浸润，抑制Treg的功能，增强抗肿瘤免疫反应，延长小鼠的生存时间［38］。

2.5 TME中其他免疫抑制性细胞

在胰腺癌TME中，除了上述细胞，还有一些细胞也发挥着免疫抑制作用。胰腺癌患者的树突状细胞通过表达吲哚胺2，3-双加氧酶抑制T细胞的抗肿瘤反应，诱导对肿瘤细胞的免疫耐受［41］。胰腺癌TME中浸润的B细胞可以通过Bruton酪氨酸激酶途径抑制抗肿瘤T细胞的应答［44］。Daley等［45］观察到胰腺癌TME存在激活的γδT细胞，能够表达PD-L1和半乳糖凝集素-9，进而抑制αβT细胞的激活，导致免疫抑制。胰腺癌TME中血管内皮细胞能够表达Fas，选择性诱导迁移而来的CD8+T细胞的凋亡，并且可以促进单核细胞和中性粒细胞的渗出以补充TME中的免疫抑制细胞［5］。

3 TME中的免疫抑制性分子

3.1 可溶性分子

在胰腺癌TME中存在大量的可溶性免疫抑制分子。①TGF-β：TGF-β主要由Treg、MDSCs等产生，可以促使Th2型T细胞、Treg、M2型巨噬细胞、N2型中性粒细胞分化，抑制CD8+T细胞的活化与增殖。②吲哚胺2，3-双加氧酶：来自TAMs、胰腺癌细胞及树突状细胞等，能够将色氨酸分解；缺乏色氨酸会导致效应T细胞的活化和增殖受到抑制［46］。③IL-10：IL-10主要来自Treg，能够抑制树突状细胞对肿瘤抗原的提呈以及NK细胞、CD8+T细胞的杀伤效应［47］。④SDF-1：由胰腺癌的TME中的基质细胞如PSCs等产生，通过SDF-1/CXCR4、SDF-1/CXCR7等途径促进肿瘤的侵袭和转移，同时也影响着TAMs向TME的募集过程。⑤IL-6：主要由TAMs、PSCs、Th2细胞等产生，可以通过JAK/STAT3途径激活MDSCs并诱导TAMs的极化，促进肿瘤上皮间质转化的形成［48］。此外，肝细胞生长因子、IL-8等其他可溶性分子均在胰腺癌的发生、发展和免疫抑制性TME的维持中有重要作用［48］。

3.2 免疫检查点受体

胰腺癌TME细胞表达抑制性共刺激分子，即免疫检查点。①PD-1和PD-L1：PD-1表达于活化的T细胞，PDL1表达于肿瘤细胞、血管内皮细胞、Treg等，两者结合可以减弱T细胞的杀伤效果，抑制抗肿瘤免疫；在胰腺癌患者中，PD-L1表达升高预示着患者的预后不良［49］。②CTLA-4和CD28：CTLA-4可以竞争性结合CD28，阻断抗原提呈细胞和T细胞相互作用，抑制T细胞的激活，并且能够促进Treg的免疫抑制作用。在多项临床试验中，研究人员发现免疫检查点抑制剂单药治疗如伊匹单抗、派姆单抗不能对胰腺癌产生较好的疗效；但联合使用不同原理的免疫治疗或将免疫治疗和化疗结合，可获得较好的疗效［1，50］。

4 总结和展望

研究者对于胰腺癌的免疫治疗已经有了诸多尝试，但胰腺癌TME的特殊结构和性质对胰腺癌的治疗造成了诸多阻碍。CAFs产生的丰富而紧密的ECM能够阻碍药物的进入和抗肿瘤免疫细胞的浸润，诸多免疫抑制细胞和分子的存在抑制了机体的抗肿瘤免疫。对于胰腺癌的治疗而言，单一的免疫治疗效果有限，因此联合免疫治疗或免疫治疗联合放疗、化疗等方法能够为治疗提供新的思路。针对TME中免疫抑制性细胞和分子的广泛研究，将提供更多的免疫治疗的潜在靶点和分子生物学证据。

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