乳及乳制品中β-内酰胺酶常用检测方法

陈少华 肖幸宇 刘凤银

摘 要：β-内酰胺酶是一类可以催化水解β-内酰胺类抗生素的水解酶，基于该原理，不法商贩为了躲避β-内酰胺类抗生素的检查，人为向乳及乳制品中加入β-内酰胺酶，营造“无抗奶”的假象，增加了乳品行业的安全风险。本文从乳及乳制品中β-内酰胺酶的稳定性、残留危害、残留现状和检测方法进行阐述，通过分析当前常用的检测方法的优劣势，包括微生物分析法、仪器检测方法、快速检测方法，旨在为乳及乳制品中β-内酰胺酶的检测方法提供参考。

关键词：乳及乳制品;β-内酰胺酶;检测方法;残留

Common Detection Methods of β-Lactamase in Milk and Dairy Products

CHEN Shaohua， XIAO Xingyu， LIU Fengyin*

（College of Biology and Food Engineering， Guangdong University of Education， Guangzhou 510303， China）

Abstract： β-Lactamases are hydrolytic enzymes that can catalytically hydrolyze β-lactam antibiotics. Based on the principle， illegal providers add β-lactamases to milk and dairy products， hide from β-lactam antibiotics antibiotic inspections and create the illusion of “no anti milk”， increasing the safety risks to the dairy industry. In this paper， the stability， residual hazards， current status and detection methods of β-lactamases in dairy and dairy products are described. The advantages and disadvantages of current common detection methods， including microbiological analysis methods， instrumental detection methods，  and rapid detection methods are analyzed to provide a reference for the detection of β-lactamases in milk and dairy products.

Keywords： milk and dairy products; β-lactamase; detection methods; residues

β-內酰胺酶是一类水解酶，可以催化水解β-内酰胺类抗生素，导致抗生素失去抑菌活性。鉴于此，一些不法商贩为了追求经济利益，没有严格遵守休药期的规定进行采奶，导致牛奶中抗生素的残留，为了躲避检查，人为添加β-内酰胺酶，营造“无抗奶”的假象。β-内酰胺酶缺少安全性评价，其加入增加了乳品行业安全风险，因此针对乳及乳制品中β-内酰胺酶的检测非常重要。目前尚未制定国家检测标准，仅在《生乳中β-内酰胺酶的测定》

（NY/T 3313—2018）中规定了生乳中β-内酰胺酶的测定方法——杯碟法[1]。本文主要从乳及乳制品中

β-内酰胺酶的稳定性、残留危害、残留现状和检测方法进行阐述，分析常用检测方法的优势与劣势，旨在为选择乳及乳制品中β-内酰胺酶的检测方法提供参考依据。

1 乳及乳制品中β-内酰胺酶的稳定性、残留危害和残留现状

1.1 乳及乳制品中β-内酰胺酶的稳定性

β-内酰胺酶具有较强的耐热性和酸碱耐受性，市售牛奶大多采用巴氏灭菌或超高温瞬时灭菌，贮存于低温或常温条件下，在该加工工艺和贮存条件下并不能使牛奶中β-内酰胺酶完全失活，仍会有β-内酰胺酶残留。

范美婧等[2]探究了牛奶中β-内酰胺酶的稳定性，采用青霉素酶活性检测试剂盒，从牛奶的保存时间、灭菌方法和酸碱处理3个方面对β-内酰胺酶活性的影响进行研究。实验结果表明，低温条件对酶活性影响不大，≤4 ℃贮存一周仍能检出各个浓度的β-内酰胺酶;常温条件下，牛奶放置时间越长，酶活性越小，且减少程度与贮存温度呈正相关关系，25 ℃和37 ℃条件下牛奶样品贮存一周，酶活性降低;长时间高温加热会掩盖低浓度β-内酰胺酶的检出，巴氏灭菌和超高瞬时灭菌等常规灭菌方法并不能使β-内酰胺酸碱完全失活;市售酸奶pH为4～5，酸碱处理均会抑制低浓度β-内酰胺酶的活性，但未完全失活，当β-内酰胺酶浓度>3 U/mL时仍能检出，pH为6和7时最为稳定。

1.2 乳及乳制品中β-内酰胺酶的残留危害

①乳及乳制品中β-内酰胺酶添加来源不明确，缺乏安全评价数据，这对我国乳及乳制品的质量管理埋下了安全隐患;②β-内酰胺酶水解抗生素生成的青霉噻唑酸分解产物具有细胞毒性，抑制细胞繁殖能力，残留产物会在肝脏蓄积，成为潜在的健康风险;③非法加入β-内酰胺酶掩盖抗生素超标的现实，不仅极易造成奶制品市场抗生素使用泛滥，而且增加了耐药基因的水平和纵向传播风险，使人们抵抗传染病能力下降、肠道菌群紊乱，从而对人体健康造成危害。

1.3 乳制品中β-内酰胺酶的残留现状

2008年卫生部发布的《食品中可能违法添加的非食用性物质名单》中将β-内酰胺酶列为重点监控指标。各个地区的乳及乳制品检测中均有不同程度的β-内酰胺酶残留，部分地区β-内酰胺酶的检出率较高，因此加强乳及乳制品中残留的β-内酰胺酶监管力度，定期执行检测任务至关重要。

齐欣等[3]（2021）采用杯碟法对辽宁省原料乳进行检测，结果186批次样品中β-内酰胺酶的检出率为12.4%;邱正勇（2019）等[4]采用胶体金检测法对河南省郑州市每月采集的60份生乳进行检测，结果β-内酰胺酶检出率波动较大，部分高达73.3%;秦婧[5]（2016）对陕西省149份生鲜乳进行检测，其阳性检出率为11.4%;候海燕（2015）[6]对江苏省淮安市149份牛奶样品进行检测，其阳性率为16.8%。

2 乳及制品中β-内酰胺酶常用检测方法

2.1 微生物分析法

杯碟法检测牛奶中β-内酰胺酶的方法已经较为成熟，该法采用对青霉素敏感的藤黄微球菌，利用舒巴坦能够特异性抑制β-内酰胺酶的活性的性质，以青霉素作为对照，通过比较加入舒巴坦和未加入舒巴坦产生的抑菌圈大小，从而间接测定牛奶中是否含有β-内酰胺酶。

《生乳中β-内酰胺酶的测定》（NY/T 3313—2018）农业行业标准规定了生乳中β-内酰胺酶测定方法杯碟法[1]，其检出限为生牛乳4 U/mL、生羊乳3 U/mL;刘旸等[7]研究两种添加藤黄微球菌的方法对牛奶中β-内酰胺酶检出限的影响，方法1制备成15 cm厚的单层培养基，方法2制备成双层培养基。实验发现方法2其抑菌圈边缘更加清晰，便于观察和测量，该方法灵敏度更高，其检出限在0.000 05～0.00 01 U/mL。

杯碟法是我国乳品行业认可的常用微生物检测方法，成本低，适用大批量检测，检测结果相对准确，但实验过程烦琐，周期长，容易出现假阳性现象，不能进行定量实验，对环境要求较高，不适用现场检测，具有一定的局限性。

2.2 仪器检测方法

2.2.1 高效液相色谱法

β-内酰胺酶能酶解青霉素，且青霉素浓度的减少量与酶活性呈线性关系，因此可以通过测定青霉素浓度减少量来间接检测β-内酰胺酶的含量。基于此原理，李雪芳等[8-9]通过离心除脂、无水乙醇除蛋白，采用高效液相色谱法测定了奶粉中β-内酰胺酶的含量，当β-内酰胺酶浓度在0.2～1.4 mg/L，与青霉素钾的减少量呈现较好的线性关系，回收率89.0%～95.0%，相对标准偏差3.0%～3.5%。

高效液相色谱法因其高灵敏度和高回收率得到广泛应用，但样品前处理较为烦琐，检测成本高，常用于实验室检测，不适合现场高通量检测。

2.2.2 分光光度法

利用β-内酰胺酶水解β-内酰胺类抗生素，其主要产物青霉噻唑酸具有还原性的性质，李滨等[10]建立检测牛奶中β-内酰胺酶的硫酸铜-紫外分光光度法，按照1∶1的比例加入三氯乙酸，辅以冷冻离心沉淀蛋白后，其最低检出限为5 U/mL;戴兴德等[11]基于青霉素分子的硫原子具有还原性，能将Fe3+还原成Fe2+，与[Fe（CN）6]3-生成可溶性普鲁士蓝，而酶水解产物和碱水解产物青霉素噻唑酸均不能与Fe3+反应，具有选择性。利用该原理，建立检测牛奶中β-内酰胺酶含量的普鲁士蓝显色光度法，该方法耗时短，仅35 min，β-内酰胺酶在4～24 U/mL与吸光值呈线性关系，检出限为0.32 U/mL，加标回收率为98.8%～101.2%。

分光光度法具有设备简单、维修方便、操作简单、实用性广、准确度和精密度好等优点，但提高其方法的選择性和降低检出限，一直是遏待解决的问题。

2.3 快速测定方法

β-内酰胺酶能水解青霉素，通过间接竞争法快速测定与β-内酰胺酶反应后残留青霉素的含量，从而间接检测出β-内酰胺酶的含量。

利用青霉噻唑酸能还原Cu2+为Cu+，与2，2-联喹啉生成紫红色络合物的性质，施春煜[12]将醋酸纤维素膜浸泡于亚铜试剂溶液中，真空干燥制成显色层，将过滤层、显色层和吸收材料粘贴在基板上，制成检测牛奶中β-内酰胺酶半定量快速测试纸，再结合分光测定仪制作标准比色卡，该方法最低检出限为6 U/mL，相对误差范围为7.51%～15.38%;张威等[13]采用Charm Rosa β-内酰胺酶试剂盒对150批乳及乳制品进行批量筛查，其检出限为4 U/mL，假阳性率为2%，灵敏度100%，特异性97.8%，具有高灵敏度和特异性，符合试剂盒快速筛查检测要求。

快速测试法具有较高的灵敏度，操作简单，检测速度快，基本能满足大批量筛选的要求，但容易出现假阳性，需结合杯碟法进一步验证。

参考文献

[1]李欣南，韩镌竹，苏崴艺.生鲜乳中β-内酰胺酶微生物法检测[J].中国乳品工业，2015，43（3）：57-59.

[2]范美婧，陈媛，蔡兴航，等.不同处理方式对乳中β-内酰胺酶稳定性的影响[J].中国乳品工业，2017，45（4）：8-10.

[3]齐欣，曲世超，薛伟锋，等.辽宁省原料乳中β-内酰胺酶的检测及结果分析[J].中国奶牛，2021（3）：49-52.

[4]邱正勇，吴玲玲，李艳芬，等.郑州市生乳中微生物污染状况和β-内酰胺酶基线数据调查[J].中国卫生检验杂志，2019，29（17）：2166-2168.

[5]秦婧，张莉，舒静，等.陕西省生鲜乳中β-内酰胺酶的检测与结果分析[J].中国乳品工业，2016，44（9）：61-64.

[6]侯海燕，刘靓，刘纯成，等.淮安市市售乳制品中β-内酰胺酶残留状况调查[J].江苏预防医学，2015，26（6）：92-93.

[7]刘旸，张丽宏，房玉国，等.杯碟法中藤黄微球菌的添加方式对生鲜乳中β-内酰胺酶检出限的影响[J].中国乳品工业，2021，49（2）：39-41.

[8]李雪芳，冯卫强，戴绚丽.高效液相色谱法检测乳粉中活性β-内酰胺酶含量[J].饮料工业，2015，18（3）：10-12.

[9]郝苗苗.乳及乳制品中β-内酰胺酶检测方法研究[J].中国饲料，2020（7）：95-98.

[10]李滨，张俊杰，徐洁，等.牛奶中β-内酰胺酶检测方法的研究[J].现代食品，2021，27（11）：186-189.

[11]戴兴德，郑小芳，火文琴，等.普鲁士蓝显色光度法测定牛奶中β-内酰胺酶的含量[J].中国生物制品学杂志，2021，34（2）：207-212.

[12]施春煜.牛奶中β-内酰胺酶半定量快速检测试纸的研究[J].农产品加工，2016（23）：11-13.

[13]张威，姜连阁.乳及乳制品中β-内酰胺酶快速检测试剂盒的比较研究[J].现代食品，2018（5）：113-116.