真核起始因子4E对小鼠动脉粥样硬化发生、发展的炎症调节作用*

鲜雪梅，毕颖超，王珍珍，门燕娟，常佳佳，陈全刚，韩旭峰，郑葵阳，陈仁金

（1.徐州医科大学 生命科学学院，江苏 徐州 221000；2.徐州医科大学 肿瘤生物治疗研究所，江苏 徐州 221006；3.徐州医科大学 基础医学院，江苏 徐州 221000）

动脉粥样硬化是一种对危害人类健康的慢性炎症性疾病，也是引起老年人死亡的最普遍的原因之一[1]。其特征在于动脉斑块中胆固醇充盈巨噬细胞的持续存在[2-6]。巨噬细胞是斑块中最丰富的炎症细胞类型。在病变中，巨噬细胞感知来自其微环境的信号（例如细胞因子或修饰的脂蛋白）发生表型极化[7-9]，这是一个随时间变化的动态过程，通过改变自身表型，根据环境信号产生促炎和抗炎作用[10]。真核起始因子4E（eukaryotic initiation factor 4E, eIF4E）在蛋白正常合成的起始阶段起重要的调控作用[11-13]，在正常情况下低表达，而在多种癌症中发生变化[14]。其对细胞的生长、发育、癌症及神经生物学有巨大影响[15]。eIF4E 翻译效率的选择性变化直接导致巨噬细胞分化和活化[16-17]。目前，eIF4E 的表达对动脉粥样硬化中的影响很少报道。本文采用分子生物学及免疫组织化学法检测eIF4E 在动脉粥样硬化斑块中的表达，以探讨其在动脉粥样硬化过程中的炎症调节作用，为治疗动脉粥样硬化提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

6 ～8 周遗传背景相同的雄性载脂蛋白E 基因敲除（ApoE-/-）小鼠（购自南京模式动物中心）和C57BL/6J 小鼠（购自北京维通利华实验动物技术有限公司）各18 只，饲养于徐州医科大学实验动物中心，饲养环境符合SPF 要求。

1.2 试剂与仪器

RAW264.7 细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，eIF4E 抗体（小鼠源）购自圣克鲁斯生物技术（上海）有限公司，Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒和TB GreenTMPremix Ex TaqTM购自大连TaRaKa 公司，考马斯亮蓝试剂购自江苏凯基生物有限公司，CD206（兔源）、CD86（兔源）购自Proteintech 公司（武汉），Alexa Fluor 488（抗鼠）、Alexa Fluor 594（抗兔）购自徐州微科曼得生物工程有限公司。

倒置荧光显微镜IX73 购自日本奥林巴斯公司，Leica 冷冻切片机购自德国徕卡公司，电泳仪和凝胶成像仪购自美国Bio-Rad 公司，Centrifuge 5804R 超低温台式离心机购自德国Eppendorf 公司，Light Cycler ®480 Ⅱ实时荧光定量PCR 仪购自罗氏诊断产品（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞分组及处理RAW264.7 细胞用含10%胎牛血清和1%青链霉素的无菌DMEM 培养基置于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养。根据细胞生长状态传代并更换新鲜DMEM 完全培养基。调整细胞密度并按每孔约1×106个细胞铺于12 孔板中，待贴壁后，其中3 孔加入脂多糖（LPS）（终浓度为200 ng/ml），将细胞诱导成M1 型巨噬细胞，为LPS 诱导组；3 孔加入白细胞介素-4（IL-4）（终浓度为20 ng/ml），将细胞诱导成M2 型巨噬细胞，为IL-4 诱导组；对照组不加药。诱导12 h 后提取RNA。按照同样的方法将细胞诱导24 h 后提取蛋白，实验重复3 次。

1.3.2 动物分组及处理将18 只ApoE-/-小鼠和18 只C57BL/6J 小鼠分成6 组，每组3 只ApoE-/-小鼠和3 只C57BL/6J 小鼠，其中C57BL/6J 小鼠为对照组。均喂食高脂饲料16 周后脱颈处死小鼠，心脏灌注5 ml 生理盐水，将腹主动脉取出后，在体视显微镜下将腹主动脉外面的脂肪剥离干净。其中3 组腹主动脉用于提取蛋白，另外3 组腹主动脉用于提取RNA，提取RNA 时不需要灌注，以免RNA 降解。同时取出ApoE-/-小鼠心脏窦部，用OCT 冷冻包埋剂包埋，置入-80℃冰箱冷冻保存，用于冷冻切片。

1.3.3 Western blotting 检测eIF4E 蛋白相对表达量分别检测各组细胞和小鼠腹主动脉中eIF4E 蛋白的相对表达量。采用裂解液（含PMSF）裂解细胞和组织（组织需匀浆），吹打均匀置冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min 离心15 min，取蛋白上清液，考马斯亮蓝法检测蛋白浓度，剩余蛋白与上样缓冲液按比例混匀，沸水浴5 min，置入-80℃冰箱冷冻保存。在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳中进行蛋白分离，冰浴条件下转至聚偏二氟乙烯膜上。用5%脱脂奶粉封闭1 h 后，加入一抗，4℃摇床孵育过夜。PBST 洗涤4次，加入相应的二抗，孵育1 h 后，PBST 洗4 次，ECL化学发光显色，成像系统拍照，用Image J 软件进行图像分析。以目的条带（eIF4E）与内参（β-actin）条带吸光面积积分的比值分析目的蛋白表达。在细胞水平检测eIF4E 蛋白在M1 型、M2 型巨噬细胞和对照组中的表达；在动物组织水平上检测eIF4E 蛋白在ApoE-/-和对照组中的表达。

1.3.4 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测eIF4E mRNA 相对表达量分别检测各组细胞和各组动物腹主动脉中eIF4E mRNA 的相对表达量。采用Trizol 法提取各组细胞和小鼠腹主动脉的总RNA（组织需匀浆），使用Prime ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒逆转录成cDNA，用TB GreenTMPremix Ex TaqTM进行qRT-PCR。eIF4E 引物：正向5'-AGGACGGTGGCTGATCACA-3'，反向5'-TCTCTAGCC AGAAGCGATCGA-3'；GAPDH 引物：正向5'-CAACTTT GGCATTGTGGAAGG-3'，反向5'-ACACATTGGGGGT AGGAACAC-3'。以GAPDH 为内参，用2-△△Ct法计算mRNA 相对表达量。所有实验重复3 次，每次设3 个生物学重复。在细胞水平检测eIF4E mRNA 在M1 型、M2 型巨噬细胞和对照组中的表达；在动物组织水平检测eIF4E mRNA 在ApoE-/-和对照组中的表达。

1.3.5 组织免疫荧光检测eIF4E 与M1 和M2 型巨噬细胞共定位表达将心脏窦部用冷冻切片机切6mm 厚，4%多聚甲醛固定15min，PBST 洗5min/次，洗3 次；0.25% Triton X-100 破膜5 min，5%封闭液室温封闭1 h；孵育兔源一抗CD206/CD86（兔源，1∶100）和eIF4E（小鼠源，1 ∶300）混合液，4℃过夜；第2 天，先室温平衡30 min，然后用PBST 洗5 min/次，洗3 次；室温孵育荧光二抗488（山羊抗鼠，1 ∶100）和594（山羊抗兔，1∶100）混合液1 h，PBST洗5 min/次，洗3次；孵育DAPI 5 min，PBST 洗5 min/次，洗3 次；抗荧光淬灭剂封片，倒置荧光显微镜观察拍照。在组织上检测eIF4E 在M1 型和M2 型巨噬细胞中的共表达。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 26.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用独立样本t检验或方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 eIF4E mRNA 和蛋白在细胞中的表达

对照组、IL-4 诱导组和LPS 诱导组细胞中eIF4E mRNA 相对表达量分别为（1.010±0.157）、（2.102±0.375）和（5.832±0.774），经方差分析，差异有统计学意义（F=23.329，P=0.000），进一步两两比较，LPS诱导组eIF4E mRNA 表达高于IL-4 诱导组（P＜0.05）。对照组、IL-4 诱导组和LPS 诱导组eIF4E 蛋白相对表达量分别为（0.130±0.032）、（0.261±0.131）和（0.606±0.134），经方差分析，差异有统计学意义（F=12.834，P=0.011），进一步两两比较，LPS 诱导组eIF4E蛋白表达高于IL-4 诱导组（P＜0.05）。见图1。

2.2 eIF4E mRNA 和蛋白在组织中的表达

对照组和ApoE-/-小鼠腹主动脉中eIF4E mRNA 相对表达量分别为（0.927±0.146）和（6.414±0.297），经独立样本t检验，差异有统计学意义（t=-33.174，P=0.000），ApoE-/-小鼠腹主动脉中eIF4E mRNA 表达高于对照组；对照组和ApoE-/-小鼠腹主动脉中eIF4E 蛋白相对表达量为（0.225±0.078）和（2.342±0.594），经独立样本t检验，差异有统计学意义（t=-6.122，P=0.004），ApoE-/-小鼠腹主动脉中eIF4E 蛋白表达高于对照组。见图2。

2.3 eIF4E 与M1 型和M2 型巨噬细胞共表达

图1 各组细胞中eIF4E mRNA 和蛋白的表达

ApoE-/-小鼠主动脉根部切片免疫荧光结果显示eIF4E 与CD86 的共定位比eIF4E 与CD206 的共定位表达多，eIF4E 在M1 型巨噬细胞中的含量高于M2 型巨噬细胞。见图3。

图2 各组小鼠腹主动脉中eIF4E mRNA 和蛋白的表达

图3 eIF4E 与M1 型和M2 型巨噬细胞共表达 （免疫荧光×100）

3 讨论

动脉粥样硬化是一种慢性炎症，炎症在动脉粥样硬化的各个阶段都发挥重要作用。在动脉粥样硬化发展和进展期间，巨噬细胞暴露于许多环境信号[18]。基于其在斑块内的定位和分布，巨噬细胞展现不同的极化状态和功能表型[19]。目前，治疗动脉粥样硬化的药物主要是降脂及抗凝等，但疗效不理想，因此仍需从基因水平和细胞分子方面探索动脉粥样硬化新疗法。

真核生物基因表达调控的一种机制是控制翻译速率，翻译调控在细胞生长、增殖和发育中起着关键作用。可以在翻译的起始、伸长和终止中的每一步控制翻译速率[20]。在翻译起始时，需要大量的真核翻译起始因子的协作才能完成。其中异源三聚体复合物eIF4F 中的eIF4E 与mRNA 5'-端帽子结构的结合是该阶段的核心。已有研究表明，eIF4E 抑制性蛋白能够通过雷帕霉素复合物1-eIF4E 结合蛋白1/2 轴协调转录，从而编码限制巨噬细胞中抗炎反应的转录程序。而eIF4E 通过与eIF4E 抑制性蛋白的结合而破坏翻译的起始过程，抑制mRNA 翻译。翻译抑制已成为炎症反应的中枢调节机制[21-22]。

本研究用分别LPS 和IL-4 诱导细胞分化成M1型和M2 型巨噬细胞后检测2 种细胞中eIF4E 蛋白和mRNA 的表达差异，结果表明eIF4E 蛋白和mRNA 在M1 型巨噬细胞中的表达均高于M2 型巨噬细胞。M1型巨噬细胞通过促炎细胞因子等加速免疫细胞内皮下招募和血管壁重塑，M2 型巨噬细胞通过抗炎细胞因子减缓动脉粥样硬化并使斑块稳定。初步说明eIF4E主要通过M1 型巨噬细胞发挥促炎作用。在ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型中，eIF4E 与CD86 的共定位表达比eIF4E 与CD206 的共定位表达多，且eIF4E 蛋白和mRNA 在ApoE-/-小鼠腹主动脉中表达也高于对照组。动物组织实验结果验证细胞实验结果，进一步说明eIF4E 在动脉粥样硬化疾病中起促炎调节作用。

综上所述，eIF4E 通过调控巨噬细胞极化起到炎症调控作用，其主要是通过调控M1 型巨噬细胞极化起到促炎调节作用。本研究仅从ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型做初步研究，后续会通过对小鼠eIF4E 和ApoE 双基因敲除后，进一步探讨其在动脉粥样硬化的发生、发展中的具体作用以及相关通路，以期为临床治疗动脉粥样硬化提供一定的理论依据。