湖南烟草靶斑病的病原鉴定及分子检测

2021-01-04肖艳松钟权吴文信李思军朱俊子钟杰

湖南农业大学学报（自然科学版） 2020年6期

肖艳松，钟权，吴文信，李思军，朱俊子，钟杰*

湖南烟草靶斑病的病原鉴定及分子检测

肖艳松1，钟权1，吴文信1，李思军1，朱俊子2，钟杰2*

(1.湖南省烟草公司郴州市公司，湖南郴州 423000；2.植物病虫害生物学与防控湖南省重点实验室，湖南长沙 410128)

2019至2020年，在湖南省郴州、永州、湘西和常德烟区发生了一种严重的叶部病害，表现为叶部出现圆形或不规则黄褐色病斑，有不规则同心纹，病斑周围可见黄绿色晕圈，后期易破裂穿孔。经组织分离、形态学观察、分子鉴定以及柯赫氏法则验证，确定该病害为烟草靶斑病，病原为立枯丝核菌(Kola)。在此基础上，以烟草靶斑病菌rDNA-ITS序列为靶标，设计特异性引物Rs-1，建立了特异性针对靶斑病菌的PCR检测体系，从烟草病斑处检测烟草靶斑病菌。

烟草；烟草靶斑病；立枯丝核菌；湖南

巴西最早发现烟草靶斑病[1]。此后，该病害在哥斯达黎加、美国北卡罗来纳州严重发生，南非、意大利、保加利亚和津巴布韦等国家也有烟草靶斑病发生，严重时造成80%以上的损失[2-3]。2005年，吴元华等[4]首次报道在中国辽宁省丹东烟区发现烟草靶斑病；随后，陆续有吉林、黑龙江、广西烟区[5]发生该病害的报道。2016年，云南省普洱市和临沧市烟区靶斑病暴发流行，造成烟叶绝收[6]。2019至2020年，笔者在对湖南省烟草病害进行调研时，发现郴州、永州、湘西和常德烟区发生了疑似靶斑病的病害，遂对病害叶片进行标本采集、组织分离、形态学和分子生物学以及柯赫氏法则鉴定，并建立了简易的检测方法。现将结果报告如下。

1　材料与方法

1.1　材料来源

2019至2020年，对湖南省郴州、永州、常德、湘西烟区发生的一种叶部病害进行调查，采集具有典型叶部发病症状的烟草叶片。

1.2　方法

1.2.1病原菌分离纯化及鉴定

利用常规组织分离法[7]对病叶进行病原菌分离。取病健交界处组织小块，经75%乙醇和0.1% HgCl2消毒、无菌水漂洗后，接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA、含链霉素50 μg/mL)上，26 ℃黑暗培养。待长出菌落后转接于PDA培养基进行纯化培养，纯化菌株保存备用。

将纯化的菌株接种于PDA培养基平板，26 ℃黑暗培养7 d后，观察菌落形态、颜色，测量其生长速率。根据病原菌的培养性状和显微形态对病原菌进行形态学鉴定。

根据柯赫氏法则对菌株进行致病性测定[8]。选取2个月大小盆栽烟草(云烟87)进行接种。每个菌株接种3盆。菌株在PDA培养基培养7 d后，打取菌落边缘菌饼，接种于烟草叶片，以无菌丝的琼脂块为对照。将植株放置于保湿装置中25 °C保湿2 d后，置于正常温室培养。观察记录发病情况。叶片发病后从病斑处再次分离病原菌并进行鉴定。

将分离纯化的菌株接种于PDA培养基上，26 ℃培养7 d。刮取菌丝，采用SDS-NaCl方法提取病原菌DNA[9]。以此为模板，对菌株的rDNA-ITS进行PCR扩增[10]。PCR扩增反应体系为：2×EsMaster Mix 25 μL，总DNA模板2 μL，10 μmol/L上、下游引物各2 μL，ddH2O 19 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测后，委托上海生物工程有限公司测序。将测得的序列用BLASTn从NCBI数据库进行同源性查找，通过MEGA 6软件的ClustalW比对后，用邻接法(NJ)构建系统进化树，采用自举法进行1 000次重复检验[11]。

1.2.2烟草靶斑病病原菌分子检测方法的建立

取0.1 g病原菌菌丝于1.5 mL离心管中，加入100 μL 1×TE溶液，用无菌枪头捣碎，12 000离心5 min，吸取上清，即获得真菌DNA粗提物。

基于rDNA-ITS序列，设计烟草靶斑病菌特异性引物Rs-1，上游5-ATCGATGAAGAACGCAGC GA-3和下游5-GGTGTGAAGCTGCAAAGACC-3，对从病原菌提取的DNA进行PCR扩增，进行引物特异性检测。以烟草赤星病菌的rDNA- ITS序列设计特异性引物Aa-1，上游5-GAACCTCTCGGGGT TACAGC-3，下游GCGAGTCTCCAGCAAAGCTA-3，作为对照引物，以烟草赤星病菌、炭疽病菌和烟草黑胫病菌为对照菌株。

在田间采集烟草靶斑病和赤星病发病的烟草植株。选取带不同大小病斑的叶片，剪取叶片病斑部分。提取带病斑叶片DNA，分别用引物Rs-1和Aa-1进行PCR检测，并以无症状健康烟草叶片为对照。

2　结果与分析

2.1　烟叶病害的症状

2019年至2020年，在湖南省郴州、永州、常德、湘西烟区发现的类似烟草靶斑病的叶部病害，从烟草下部叶片开始发病，迅速向上部叶片扩展。发病初期病斑小，水浸状，后扩展成近圆形或不规则形状，边缘黄褐色，中央颜色略浅，有不规则同心纹，迎着光线，可观察到病斑中央有灰白色靶点，病斑周围可见褪黄绿色晕圈。后期病斑易破裂穿孔，且病斑融合引起叶片枯萎坏死(图1)。

1　烟株苗期叶片病害症状；2、3　成株期烟叶病害症状。

2.2　分离病原菌的鉴定结果

对采集的烟草叶片病样进行组织分离，共获得28个菌落形态一致的菌株。将分离的菌株于PDA培养基上26 ℃恒温培养，生长速率为24.80 mm/d。菌丝初为白色，后变为黄褐色。菌丝有分隔，分支夹角接近90°，在分割处有缢缩，且分隔处附近有隔膜(图2)。

利用菌饼活体接种云烟87叶片，4 d后烟草叶片出现明显的坏死症状：病斑初为水浸状，后逐渐扩大，周围有黄色晕圈，病斑易穿孔(图3)。从接种发病病斑处再次分离得到的病原菌，经形态学和分子检测，鉴定为烟草靶斑病病菌。根据柯赫氏法则，确定该病害为烟草靶斑病，病原为立枯丝核菌()。

图3　分离菌株接种烟草后叶片发病症状

对代表菌株CZBB-Y1的rDNA-ITS基因区域进行PCR扩增测序，获得了长度约为697 bp的片段。将测得的序列提交至NCBI的GenBank(登录号MW255345)，BLASTn同源性搜索比对显示，其与AG-3的ITS序列具有100%的一致性，序列覆盖率为96%。利用ITS构建系统进化树，结果，菌株CZBB-Y1与聚在一簇(图4)。结合形态特征和分子鉴定，确定菌株CZBB-Y1为立枯丝核菌()。

图4　基于靶斑病菌株CZBB-Y1, R. solani和其他Rhizoctonia属菌株ITS序列的系统进化树

2.3　烟草靶斑病菌的分子检测

烟草靶斑病常与赤星病混合发生，易混淆。为了对烟草靶斑病进行及时准确的诊断，基于rDNA-ITS序列设计了烟草靶斑病菌特异性引物Rs-1和Aa-1，并用简易法提取了病原真菌的DNA进行PCR扩增，以验证引物的特异性。结果表明，引物Rs-1能特异地扩增烟草靶斑病菌中预期大小片段，而烟草赤星病菌、炭疽病菌和烟草黑胫病菌无扩增片段。同时，引物Aa-1可特异地扩增出烟草赤星病菌中预期片段，但烟草靶斑病菌、炭疽病菌和烟草黑胫病菌无扩增片段(图5)。

M　Marker；泳道1~4　分别代表引物Rs-1对烟草靶斑病菌、赤星病菌、炭疽病菌、黑胫病菌的PCR扩增；泳道5~8　分别代表Aa-1对烟草靶斑病菌赤星病菌、炭疽病菌、黑胫病菌的PCR扩增。

用设计的特异性引物分别对感染烟草靶斑病和赤星病的烟草叶片病斑进行检测。挑取病斑处坏死组织，利用简易法提取DNA，以此为模板，PCR扩增结果显示，利用引物Rs-1可特异性扩增出阳性烟草靶斑病菌和感染靶斑病病斑中的特异性片段，而对健康叶片和烟草赤星病病斑无扩增片段(图6)。引物Aa-1可特异地扩增出阳性烟草赤星病菌和赤星病病斑的特异性片段，而对照健康叶片和烟草靶斑病叶片无扩增片段。说明引物能满足快速检测并区分烟草靶斑病和赤星病的诊断要求。

M　Marker；泳道1~6　分别为引物Rs-1对烟草靶斑病菌、靶斑病大病斑、靶斑病中号病斑、靶斑病小病斑、赤星病病斑、健康烟草叶片PCR扩增；泳道7~12　分别为引物Aa-1对烟草赤星病菌、赤星病病斑、靶斑病大病斑、靶斑病中号病斑、靶斑病小病斑、健康烟草叶片PCR扩增。

3　结论与讨论

通过病害症状观察、组织分离、形态学观察、ITS基因序列分析和致病力测定，鉴定了湖南烟区发生的烟草靶斑病，确定其病原菌为立枯丝核菌[12-13]。

立枯丝核菌寄主范围非常广泛，可引起茎腐病、纹枯病和苗期立枯病等多种植物病害。在烟草上，立枯丝核菌主要引起苗期病害，一般条件下很难产生有性孢子，孢子的生活力也十分脆弱，但烟草靶斑病是丝核菌通过有性孢子传播引起的叶部病害。

烟草靶斑病菌株间的融合群具有多样性，同时不同地域的菌株也具有其独特性。部分研究[6,14-17]显示，中国云南和东北部分地区的烟草靶斑病菌属于相同的AG-3融合群，而陈媛媛等[5]发现从广西分离到的部分烟草靶斑病菌属于AG-2和AG-4融合群，这与20世纪80年代在美国卡罗莱纳州北部发现部分AG-4菌株可引起烟草靶斑病的结果类似[2]。MERCADO等[18]首次报道在阿根廷西北地区烟草上发现引起烟草靶斑病的立枯丝核菌AG-2.1融合群。随后又发现该区域烟草上的AG4HG-I和AG4HG-III融合群菌株主要引起烟草立枯病，AG2-1既可引起立枯病，也可引起靶斑病[19]。这些研究结果说明丝核菌不同融合群与其分离的地理环境、发病部位和侵染方式等有关。对不同烟区发生的烟草靶斑病病原进行分离鉴定，将为探讨菌株的融合群和菌株间的遗传多样性分化，为研究病原菌种群遗传变异及对该病害发生流行预测提供依据。

由于烟草靶斑病易与烟草赤星病、野火病、炭疽病等同时发生，容易造成混淆，传统的鉴定方法需要经过病原菌分离、纯化、培养等过程，耗时长，在病害流行时易造成误诊，因而延误最佳防治时期。笔者依据烟草靶斑病菌和赤星病菌序列设计特异性引物，提取病原真菌DNA后，可直接快速地从烟草病害的病斑处检测并区分烟草靶斑病和赤星病，为烟草靶斑病的检测与诊断提供了工具，但由于烟草靶斑病菌的遗传背景复杂，对于该检测方法是否可应用于所有地区的烟草靶斑病检测，还需通过检测更多的样本来验证。

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Pathogen identification and molecular detection of tobacco target spot in Hunan Province

XIAO Yansong1, ZHONG Quan1, WU Wenxin1, LI Sijun1, ZHU Junzi2, ZHONG Jie2*

(1.Chenzhou Tobacco Company of Hunan Province, Chenzhou, Hunan 423000, China; 2.Hunan Provincial Key Laboratory for Biology and Control of Plant Diseases and Insect Pests, Changsha, Hunan 410128, China)

From 2019 to 2020, a serious leaf disease was found in Hunan Province including Chenzhou, Yongzhou, Xiangxi and Changde. Symptoms displayed as round or irregular brown spots, with irregular concentric pattern and yellow-green halo and later the infected leaves were easy to rupture and perforate. The pathogen was confirmed to beKola via tissue isolation, morphological observation, molecular identification and Koch’s Postulates. On this basis, a direct PCR method for detection of tobacco target spot was established using the specific primers Rs-1F and Rs-1R designed based on the rDNA-ITS sequence of the pathogen. Using this method, the pathogen fungus could be detected directly from the disease spots on tobacco leaves.

tobacco; tobacco target spot;; Hunan Province

S435.72

1007-1032(2020)06-0711-05

肖艳松，钟权，吴文信，李思军，朱俊子，钟杰．湖南烟草靶斑病的病原鉴定及分子检测[J]．湖南农业大学学报(自然科学版)，2020，46(6)：711-715．

XIAO Y S, ZHONG Q, WU W X, LI S J, ZHU J Z, ZHONG J. Pathogen identification and molecular detection of tobacco target spot in Hunan Province[J]. Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences), 2020, 46(6): 711-715.

http://xb.hunau.edu.cn