新型冠状病毒肺炎康复者恢复期血浆制备过程对SARS-CoV-2 IgG抗体滴度的影响*

郑 雪， 包安裕， 瞿 珍， 许婷婷， 谢松丽△

1武汉血液中心，武汉 4300302武汉大学人民医院检验科，武汉 430060

在新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情期间，武汉血液中心自2020年2月13日起开始执行新冠肺炎康复者恢复期血浆的采集制备和发放任务，我中心承担其中的制备工作，主要流程为分装、病毒灭活及-30℃速冻。根据《新冠肺炎康复者恢复期血浆临床治疗方案(试行第二版)》的要求，新冠肺炎康复者血浆中具有治疗价值的是IgG抗体[1]，且新冠肺炎病毒特异性IgG抗体是既往感染病毒的指示指标，故本研究只讨论血浆制备过程中的各种因素对IgG抗体滴度的影响。

由于新冠肺炎病毒核酸检测可能存在假阴性或假阳性，因此结合血清特异性病毒抗体检测有助于弥补核酸检测不足，同时对流行病学调查和疾病诊断起到辅助作用。国家卫生健康委员会《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》对于确诊病例增加了有关病毒特异性抗体检测内容，其中IgM抗体和IgG抗体同时阳性或血清IgG抗体由阴性转为阳性或恢复期较急性期4倍及以上升高可以作为确诊病例的诊断依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

随机选取2020年2月至3月在武汉血液中心无偿捐献血浆的新冠肺炎康复者50名，其中男性30名，女性20名，平均年龄37.4岁。首次捐献者41名，第2次捐献者9名。检验科测定IgG抗体滴度大于1∶160的有38名，小于1∶160的有12名。留取捐献者血浆病毒灭活前后的血浆样辫，置于-20℃保存。

1.2 检测方法

亚甲蓝/光化学病毒灭活使用的是上海输血技术有限公司生产的一次性使用病毒灭活输血过滤器材和灭活柜。血浆辫在天商公司生产的天商-20℃冷库中保存。IgG抗体滴度检测由新波生物技术有限公司生产的2019-nCoV IgG抗体检测试剂盒检测，为科研试用试剂，使用其公司配套的型号为SuperFlex全自动化学发光免疫分析仪进行检测分析。

采用SARS-CoV-2阴性血浆对50份灭活前后的血浆标本进行倍比稀释，共设置了7个稀释梯度，分别为1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280、1∶2560，吸取稀释后样本各10 μL分别上机检测。使用磁微粒化学发光免疫分析法检测灭活前后的抗体滴度。使用同样的方法对采集的血浆标本在冻存前和-20℃冻存4个月后进行SARS-CoV-2 IgG抗体滴度检测。

抗体滴度≥1∶160的血浆标本判定为合格标本，抗体滴度<1∶160的血浆标本判定为不合格标本。记录实验所得的化学发光量值，并转换为抗体滴度等级。

1.3 统计学方法

使用SPSS 22.0软件对灭活前后、冻存前后的血浆标本IgG抗体滴度进行Wilcoxon秩和检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 亚甲蓝/光化学法灭活对IgG抗体滴度的影响

使用亚甲蓝/光化学法灭活新冠肺炎康复者恢复期血浆，灭活前后的抗体滴度差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

2.2 -20℃冰冻保存对IgG抗体滴度的影响

本研究中的样本在捐献者捐献后即进行IgG滴度检测，将样本置于-20℃冷库保存4个月，再次检测IgG抗体滴度，Wilcoxon配对秩和检验显示，冻存前后抗体滴度差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

3 讨论

新冠肺炎康复者恢复期血浆是患者在早期感染时激发体液免疫产生的针对病原的特异性抗体，康复后采集该患者的血浆所获得的血浆制剂[2]。重症患者输注康复者恢复期血浆可以中和体内感染病原，清除血液循环中的病原体以缓解病情[3]。2020年2月14日，国家卫生健康委员会发布文件《新型冠状病毒肺炎重症、危重症病例诊疗方案(试行第二版)》，将输注恢复期血浆治疗作为一种特异性治疗方案加以推广，并对捐献者抗体水平做出规范要求[4-5]。根据《新冠肺炎康复者恢复期血浆临床治疗方案(试行第二版)》相关规定，血浆IgG抗体滴度大于1∶160或总抗体滴度大于1∶320时可用于临床重症患者治疗[4]，本研究中的50份血浆标本中IgG抗体滴度合格(滴度大于1∶160)标本38份，IgG抗体滴度不合格(滴度小于1∶160)标本12份。

抗体滴度2、4、6分别代表1∶80、1∶320、1∶1280的滴度水平图1 亚甲蓝/光化学法灭活对IgG滴度的影响Fig.1 Influence of methylene blue/photochemical inactivation on IgG titer

抗体滴度2、4、6分别代表1∶80、1∶320、1∶1280的滴度水平图2 血浆标本冻存前后IgG抗体滴度的变化Fig.2 The change of IgG titer before and after plasma freezing

对血液制品进行病毒灭活可采用多种方法，亚甲蓝/光化学法灭活血浆病毒是近年来应用的新技术，在国内应用最为广泛，可使大多数的脂质包膜病毒和部分的非脂质包膜病毒灭活，特别是对HCV、HBV、HIV等病毒的灭活效果非常好。有研究显示亚甲蓝/光化学法可以高效灭活血浆中的脂包膜病毒，对SARS病毒也具有较强灭活作用[6]。我中心在制备新冠肺炎康复者恢复期血浆时，对每单位血浆都进行了病原灭活，以确保输注的安全性[7]。由于IgG抗体是一种糖蛋白，亚甲蓝/光化学法主要作用于病毒核酸和脂包膜上[8]，故对血浆中抗体生物活性影响较小。本研究50份灭活前后样本对比也证实了这一点。但其中有1份显示灭活前滴度大于1∶2560，灭活后滴度降到1∶160。为了排除取样和操作误差，我们重新测试了一遍，结果与上述无差。我们又将此标本原液和另外随机4份标本原液进行了56℃ 30 min的热灭活，此标本灭活后IgG抗体滴度降至1∶1280，而其他4份标本IgG抗体滴度未变。回顾性调查献浆者捐献资料，发现该献浆者是4次捐浆中的第2次，第4次IgG抗体滴度检测不合格。此特例情况未在其他文献中找到可能原因，还需进一步深入研究。

我中心在血浆灭活后还进行了-30℃ 30 min速冻，并-20℃冷库保存。目前有研究显示，恢复期患者特异性血浆抗体在冰冻状态下可以保持6个月到1年，或更长时间[9]。在实际工作中，新鲜冰冻血浆有效期为1年，普通冰冻血浆保存有效期更长，能保证血浆抗体的有效性。本研究显示新冠康复者恢复期血浆的冰冻时间至少在4个月内IgG抗体滴度无明显衰减，但血浆中新冠特异性IgG抗体在冰冻保存条件下能保证临床治疗有效的最长期限的准确数据，还需要更多样本来支持进一步的研究。

以上研究可以初步判定我中心在新冠肺炎康复者恢复期血浆制备上流程合理，对血浆中IgG抗体的保存基本没有负面影响。武汉作为曾经是疫情最严重的国内城市，积极响应政府号召，仍在持续招募和采集新冠肺炎康复者恢复期血浆，希望在短时间内能建立新冠恢复期血浆库，以期在临床的对症治疗，乃至疫苗研发和治疗性抗体制备中发挥作用。