利拉鲁肽对乳腺癌细胞生物学特性的影响及其机制研究*

赵 琳， 朱争艳， 朱宏飞， 徐元萍， 武华军

武汉市第三医院(武汉大学同仁医院) 1药学部 2妇科，武汉 4300603湖北省中医院麻醉科，武汉430061

迄今为止，癌症仍是全球范围内人类死亡的最主要原因之一，是世界性的问题，严重威胁着人类的健康及社会的发展。乳腺癌是全球女性中发病率及死亡率均居首位的恶性肿瘤[1]，在过去的30年里，虽然乳腺癌的临床治疗得到了显著的改善，但仍是全球半数以上女性癌症相关死亡的主要原因[2]。因此，探讨乳腺癌的发生发展机制，寻找新的药物靶点，对乳腺癌新治疗策略的提出具有重大意义。研究发现，人附睾蛋白4(human epididymis protein 4，HE4)在乳腺癌中呈高表达，可通过影响细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)和蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)信号通路促进乳腺癌的发生发展[3]。而且，HE4在乳腺癌的发生及复发中具有诊断价值，可作为早期检测和诊断乳腺癌的候选生物标志物[4]。

利拉鲁肽是一种新型降糖药，而糖尿病与部分肿瘤的发生密切相关，研究显示，利拉鲁肽可抑制乳腺癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡，发挥抗乳腺癌的作用，可能与p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信号通路相关[5-6]。但利拉鲁肽与乳腺癌发生发展机制的关系并未完全明确，本研究将深入探讨利拉鲁肽是否通过HE4影响乳腺癌细胞的生物学行为，并阐述其作用机制，为利拉鲁肽临床治疗乳腺癌提供药物靶点及理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

1.1.1 试剂 人乳腺癌MCF-7细胞(中国科学院细胞库)；利拉鲁肽(诺和诺德制药有限公司)；DMEM(美国Hyclone公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；二甲基亚砜(美国Sigma公司)；载体pSIREN(美国Addgene公司)；内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ(美国NEB公司)；反转录试剂盒(日本TaKaRa公司)；SYBR Green PCR试剂盒(美国KAPA Biosystems公司)；Matrigel胶、Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡检测试剂盒(美国BD公司)；兔抗HE4、兔抗Bad、兔抗Bcl-2和Caspase-3抗体(武汉Bioswamp)；兔抗PI3K、兔抗p-PI3K、兔抗AKT、兔抗p-AKT、兔抗ERK及小鼠抗p-ERK抗体(英国Abcam公司)。

1.1.2 仪器 倒置显微镜(德国Leica公司)；酶标仪(美国Thermo公司)；荧光定量PCR仪、凝胶成像系统(美国Bio Rad公司)；Transwell小室(美国康宁)；流式细胞仪(美国BECKMAN公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞复苏与培养 将MCF-7细胞从液氮罐中取出，于37℃水浴中解冻，待冻存液完全融化后，将细胞悬液转移至新的离心管中。1000 r/min离心3 min，弃上清，加入1 mL DMEM悬浮细胞沉淀，转移至培养瓶中，再加入4 mL含10%胎牛血清的DMEM，置于37℃，5% CO2培养箱中培养。

1.2.2 MTT法筛选利拉鲁肽半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，IC50) 收集处于对数生长期的MCF-7细胞，调整细胞密度后接种于96孔板中，每孔180 μL，约1×103个细胞，于37℃，5% CO2培养箱中培养过夜，待细胞贴壁。加入不同浓度(0、10、50、100、500和1000 nmol/L)的利拉鲁肽，培养24 h。加入20 μL浓度为5 mg/mL的MTT溶液，继续培养4 h。吸去培养液上清，加入150 μL二甲基亚砜溶解液，振荡10 min后，酶标仪检测490 nm处的吸光度(A)值，计算利拉鲁肽干预MCF-7细胞的IC50。

1.2.3 si-HE4重组质粒构建 基于GenBank公布的HE4基因序列(NM_006103.3)，设计HE4干扰靶序列进行合成，上游引物：5′-GATGAAATGCTGCCGCAAT-3′，下游引物：5′-TGACCAGA-ACTGCACGCAA-3′，阴性对照序列：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。采用内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，使载体线性化，与目的基因片段连接，经过阳性克隆鉴定后筛选出重组质粒，并转染MCF-7细胞。

1.2.4 RT-PCR检测转染效率 转染24 h后，RT-PCR检测MCF-7细胞中HE4表达水平。实验过程如下：提取细胞总RNA，采用反转录试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板进行RT-PCR扩增，以GAPDH为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算HE4 mRNA相对表达量。引物序列见表1。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 RT-PCR primer sequences

1.2.5 实验分组及处理 收集对数生长期的MCF-7细胞，接种于12孔板中，每孔1 mL，约4×105个细胞。将细胞分为对照组、阴性对照(si-NC)组、si-HE4组、利拉鲁肽组、si-HE4+利拉鲁肽组。si-NC组和si-HE4组细胞分别进行阴性对照质粒和si-HE4重组质粒转染；利拉鲁肽组细胞则是采用IC50的利拉鲁肽进行干预；si-HE4+利拉鲁肽组细胞经过si-HE4重组质粒转染后，再采用IC50利拉鲁肽继续干预。

1.2.6 划痕实验观察细胞迁移 在6孔板背后均匀画横线，横穿过孔，每孔至少穿过5条横线。每孔接种约1×106个细胞，培养过夜，待细胞铺满孔板。第2天用无菌枪头垂直于孔板背后的横线划痕，PBS洗去划下的细胞，并加入无血清培养液继续培养。在0、24和48 h分别拍照，观察细胞迁移情况。

1.2.7 Transwell小室侵袭实验观察细胞侵袭 实验前24 h，将细胞培养于不含血清的培养液，进行血清饥饿处理。采用PBS将24孔板和Transwell小室浸泡5 min，进行湿润。在小室中铺设80 μL Matrigel(基质胶)，在培养箱中放置30 min。消化细胞，PBS重悬后，将细胞密度稀释到1×105个/mL，取0.5 mL细胞悬液接种于Transwell小室中，下层24孔板中加入750 μL含10%胎牛血清的培养液，培养48 h。每孔中加入1 mL 4%多聚甲醛室温固定15 min，弃去固定液，PBS洗涤，再加入1 mL 0.5%结晶紫溶液染色30 min，PBS洗涤并晾干。擦去Transwell小室中没有穿过基质胶的细胞，于显微镜下拍照观察细胞侵袭情况，并计数每个视野中的细胞数量。

1.2.8 流式细胞术检测细胞凋亡 收集细胞，PBS洗涤后，消化细胞，待轻轻吹打可将贴壁细胞吹打下来时，停止消化。收集细胞悬液，转移至离心管中，1000 r/min离心5 min，弃上清，PBS重悬细胞沉淀后进行细胞计数。取约5×105个细胞，1000 r/min离心5 min，弃上清，加入200 μL Binding buffer重悬细胞，再加入10 μL Annexin Ⅴ-FITC和10 μL PI，混匀后避光孵育30 min。加入300 μL Binding buffer后，于流式细胞仪进行检测。

1.2.9 Western blot检测蛋白表达 提取细胞总蛋白，BCA法进行蛋白定量，以每孔20 μg蛋白上样量进行SDS-PAGE。电泳结束后将蛋白转印至PVDF膜上，室温封闭2 h。将膜分别放入加有HE4(1∶1000)、PI3K(1∶1000)、p-PI3K(1∶1000)、AKT(1∶500)、p-AKT(1∶1000)、ERK(1∶1000)、p-ERK(1∶10000)、Bad(1∶1000)、Bcl-2(1∶1000)、Caspase-3(1∶1000)、GAPDH(1∶1000)抗体的孵育盒中，室温孵育1 h。用含0.05% Tween-20的PBS(PBST)洗涤3次后，加入按照1∶10000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗进行室温孵育1 h。PBST洗涤3次后，加入化学发光试剂，并检测各蛋白条带的灰度值，以目的蛋白与GAPDH的灰度值比作为其相对表达量。

1.3 统计学方法

本研究数据采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两组间均数比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 利拉鲁肽干预浓度筛选

MTT法检测不同浓度利拉鲁肽干预下的细胞活性，随着利拉鲁肽浓度的升高，细胞存活率降低(图1)，计算得出利拉鲁肽干预MCF-7细胞24 h的IC50为315.448 nmol/L，以该浓度为后续实验中利拉鲁肽组的干预浓度。

2.2 转染效率检测

si-HE4重组质粒转染24 h后检测细胞中HE4 mRNA表达水平，结果显示：与对照组比较，si-HE4组HE4 mRNA表达水平明显降低(P<0.05)，见图2，提示本研究转染实验成功。

图1 MTT检测细胞存活率Fig.1 Detection of cells survival rates by MTT assay

与对照组比较，*P<0.05图2 RT-PCR检测细胞中HE4 mRNA的表达Fig.2 Detection of HE4 mRNA expression by RT-PCR

2.3 利拉鲁肽与si-HE4对MCF-7细胞迁移的影响

随着迁移时间的延长，与对照组比较，si-HE4组、利拉鲁肽组及si-HE4+利拉鲁肽组迁移细胞少，划痕间距大，48 h时差异均有统计学意义(均P<0.05)，见图3。提示利拉鲁肽和沉默HE4均可抑制乳腺癌MCF-7细胞迁移。

2.4 利拉鲁肽与si-HE4对MCF-7细胞侵袭的影响

与对照组相比，si-HE4组、利拉鲁肽组及si-HE4+利拉鲁肽组侵袭细胞数量均明显减少(P<0.05)；与si-HE4组或利拉鲁肽组比较，si-HE4+利拉鲁肽组侵袭细胞数量亦明显减少(P<0.05)，见图4。提示利拉鲁肽和沉默HE4均可抑制乳腺癌MCF-7细胞侵袭。

2.5 利拉鲁肽与si-HE4对MCF-7细胞凋亡的影响

与对照组相比，si-HE4组、利拉鲁肽组及si-HE4+利拉鲁肽组细胞凋亡率均明显升高(均P<0.05)；与si-HE4组或利拉鲁肽组比较，si-HE4+利拉鲁肽组细胞凋亡率更高，差异具有统计学意义(均P<0.05)，见图5。提示利拉鲁肽和沉默HE4可诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡。

与对照组比较，*P<0.05；与si-HE4组比较，#P<0.05图3 划痕实验观察细胞迁移(×100)Fig.3 Observation of cells migration by scratch test(×100)

1：对照组；2：si-NC组；3；si-HE4组；4：利拉鲁肽组；5：si-HE4+利拉鲁肽组；与对照组比较，*P<0.05；与si-HE4组比较，#P<0.05；与利拉鲁肽组比较，&P<0.05图4 Transwell小室实验观察细胞侵袭(×200)Fig.4 Observation of cells invasion by transwell chamber(×200)

2.6 利拉鲁肽与si-HE4对MCF-7细胞相关蛋白表达的影响

与对照组比较，si-NC组细胞中各蛋白表达水平差异均无统计学意义(均P>0.05)，而si-HE4组、利拉鲁肽组、si-HE4+利拉鲁肽组细胞中HE4、p-PI3K、p-AKT、p-ERK、Bcl-2蛋白相对表达量均明显降低(均P<0.05)，Bad和Caspase-3表达明显升高(均P<0.05)；与si-HE4组或利拉鲁肽组比较，si-HE4+利拉鲁肽组HE4、cAMP、p-PI3K、p-AKT、p-ERK、Bcl-2蛋白表达进一步降低(均P<0.05)，Bad和Caspase-3表达进一步升高(均P<0.05)。见表2和图6。

1：对照组；2：si-NC组；3；si-HE4组；4：利拉鲁肽组；5：si-HE4+利拉鲁肽组；与对照组比较，*P<0.05；与si-HE4组比较，#P<0.05；与利拉鲁肽组比较，&P<0.05图5 流式细胞术检测细胞凋亡率Fig.5 Detection of apoptotic rate by flow cytometry

表2 各蛋白表达水平比较Table 2 Comparison of protein expression

1：对照组；2：si-NC组；3：si-HE4组；4：利拉鲁肽组；5：si-HE4+利拉鲁肽组图6 Western blot检测蛋白表达Fig.6 Detection of protein expression by Western blotting

3 讨论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，大量流行病学研究显示，糖尿病与乳腺癌之间存在密切关联[7-8]。利拉鲁肽是一种通过DNA重组技术生成的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂，常用于临床治疗糖尿病[9]。据报道，利拉鲁肽具有潜在的抗乳腺癌作用，研究显示利拉鲁肽可抑制MCF-7细胞的增殖，诱导细胞凋亡[10]。但关于利拉鲁肽抗乳腺癌的作用机制，目前并未完全阐述明确。HE4是具有免疫保护作用的蛋白酶抑制剂家族成员之一，在卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌等肿瘤组织中高表达[3，11]。当HE4低表达时，乳腺癌细胞增殖能力减弱，细胞凋亡增多，细胞移植瘤生长缓慢[12]，说明抑制HE4表达可望达到治疗乳腺癌的效果。基于上述研究报道，我们猜想利拉鲁肽对乳腺癌的治疗作用可能与HE4的表达水平有关，为验证此猜想，本研究使用IC50利拉鲁肽干预乳腺癌细胞，观察其与沉默HE4基因对乳腺癌细胞生物学特征的影响。结果显示，IC50利拉鲁肽和沉默HE4基因均可抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡，发挥抗乳腺癌作用，两者联合处理后效果更显著，而且IC50利拉鲁肽干预乳腺癌细胞亦可降低HE4蛋白表达。

Bcl-2家族在细胞凋亡调控中发挥关键性作用，该蛋白家族包括抗凋亡和促凋亡成员，其中抗凋亡成员包括：Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w等，而促凋亡成员分为两组，Bax组(包括：Bax、Bak和Bok)和BH3-only蛋白(包括Bad、Bim、Bid等)[13]。研究发现，Bad与Bcl-2均与细胞中线粒体凋亡途径有关，促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白间的相互作用改变线粒体通透性，控制着线粒体色素C(Cyt-c)等物质从线粒体中释放出来，通过线粒体途径触发Caspase凋亡反应[14-15]。在本次研究中，利拉鲁肽组和si-HE4组细胞中抗凋亡Bcl-2蛋白表达下调，而Bad和Caspase-3表达上调，且si-HE4+利拉鲁肽组中蛋白表达差异更明显。

在乳腺癌细胞中，PI3K/AKT/mTOR通路是最常见的失调途径之一，该通路过表达和激活与癌细胞的生长及预后不良有关，被认为是乳腺癌潜在的治疗靶点[16]。Woo等[17]研究也证实了抑制PI3K/AKT/mTOR通路的激活，可抑制乳腺癌细胞的增殖，诱导细胞发生凋亡，且通路的抑制效果越好，对乳腺癌细胞发挥的抗肿瘤活性就越强。ERK磷酸化在细胞增殖和凋亡中的作用一直以来存在争议，但相关实验数据显示，抑制乳腺癌细胞中AKT和ERK磷酸化可发挥抑制细胞增殖，促进凋亡的治疗效果[18]。本次研究结果显示，利拉鲁肽和干扰HE4表达均可抑制乳腺癌细胞中PI3K、AKT及ERK的磷酸化水平，两者联合处理的抑制效果更强。

结合上述结果分析，提示利拉鲁肽可能通过抑制乳腺癌细胞中HE4的表达，影响PI3K/AKT及ERK信号通路的激活，从而影响乳腺癌细胞的生物特性。本研究结果在前人研究的基础上，从体外研究进一步阐述了利拉鲁肽对乳腺癌的治疗机制，但还需通过体内实验进行深层次的验证。