鱼露生物胺研究进展

白妞妞，白锴凯，何建林，洪碧红*，张怡

1(福建农林大学 食品科学学院，福建 福州，350002) 2(自然资源部第三海洋研究所海洋生物资源开发利用工程技术创新中心，福建 厦门，361005)

生物胺(biogenic amine，BA)是一种广泛存在于肉制品、水产品、乳制品及发酵调味品等食品中的小分子有机化合物。其结构具有多样性，可分为脂肪胺(尸胺、腐胺、精胺和亚精胺)、芳香胺(苯基乙胺和酪胺)或杂环胺(组胺和吡咯烷)。在人体中，生物胺作为激素或神经递质发挥着关键的生物学功能，是生物活性细胞不可或缺的组成部分。低浓度的生物胺对人体健康无害，而高浓度的生物胺具有毒性[1]。一般摄入超过100 mg/kg食物的生物胺，就会使人体的排毒系统受阻从而导致中毒，危害人体神经和心血管系统，严重者甚至危害生命。组胺浓度过高会抑制组氨酸酶的活性，导致人体代谢紊乱，酪胺中毒会导致高血压，而尸胺、腐胺、精胺、亚精胺易于与亚硝酸盐反应产生致癌物质亚硝胺。

鱼露是以鱼的副产物或鱼内脏为原料，加入30%～40%(质量分数)的盐，在太阳下暴晒发酵1～2年的鱼酱油产品，营养价值高、味道鲜美。自然发酵是生产优质鱼露的关键步骤，但是该过程也会产生大量的生物胺，其中含量最高的是组胺，其次是酪胺。近年来，科研人员研究了鱼露快速发酵技术，如外加酶、加曲或微生物等方法，有效缩短了发酵时间，减少了不良风味，但鱼露样品中生物胺含量容易超标。少量的生物胺能够改善鱼露风味，但过量的生物胺会降低鱼露的新鲜度，影响鱼露的品质。因此，探讨鱼露中生物胺的形成机理及控制方法，对改善鱼露品质、开发鱼露调味品市场具有重大意义。

1 鱼露中生物胺形成机理

食品中大部分生物胺是在微生物作用下使某些氨基酸发生脱羧反应形成的，还有少部分是通过醛或酮的胺化或转胺作用形成[2]。鱼露中生物胺的形成主要是游离氨基酸在相应的氨基酸脱羧酶作用下发生的脱羧反应[3]。其具体转化过程如图1所示。

图1 鱼露发酵过程中常见的生物胺转化过程Fig.1 Common biogenic amine transformation process in fish sauce fermentation process

鱼体本身含有丰富的蛋白质等营养成分，为产胺菌和产蛋白酶菌的生长提供了良好的生态环境。蛋白质经产蛋白酶菌分解后产生组氨酸、酪氨酸、赖氨酸和鸟氨酸等小分子物质为生物胺的形成提供了前体物质。鱼露发酵过程会产生大量的产组胺菌，这些组胺菌具有产组氨酸脱羧酶的活性，游离的组氨酸在这些组氨酸脱羧酶作用下发生脱羧反应从而产生组胺，游离的酪氨酸在产酪胺菌的酪氨酸脱羧酶作用下发生脱羧反应从而产生酪胺。类似的，鱼露中其他生物胺的产生也是游离氨基酸在相应产胺菌的氨基酸脱羧酶作用下发生脱羧反应转化而来的。

2 鱼露中生物胺产生菌

鱼露生物胺的形成离不开生物胺产生菌。近年来，科研人员从食物中分离出很多生物胺产生菌，包括乳酸菌、肠杆菌、巴斯德菌、沙门菌群、根瘤菌、葡萄球菌属和假单胞菌属等[4-6]。这些菌都具有产生不同活力大小的氨基酸脱羧酶活性。其中乳酸菌、肠杆菌和球菌是鱼露发酵过程中生物胺的主要产生菌。

2.1 乳酸菌

鱼露因其独特风味备受人们喜爱，但发酵过程生物胺的形成对其品质造成了极大的影响，其中组胺是影响最大的生物胺。在发酵食品中，组胺主要由乳酸菌产生。常见的产组胺乳酸菌属有肠球菌、酒球菌、片球菌和乳杆菌。鱼露中的好盐性乳酸菌能产生组胺酸脱羧酶，将组氨酸变换成组胺[7]。

2.2 肠杆菌

产气肠杆菌和阴沟肠杆菌是鱼露发酵过程中最常见的尸胺和腐胺产生菌，其中产气肠杆菌产尸胺的能力较强，阴沟肠杆菌产腐胺能力较强。刘红等[8]采用改良的Niven′s生物胺筛选培养基，从秋刀鱼肉中分离鉴定出14株产胺菌，在4 ℃条件下，所有产胺菌产胺能力均较弱，在25 ℃条件下，肠杆菌属的产组胺能力较强，结果显示，秋刀鱼肉中生物胺的含量大部分都来源于肠杆菌属。

2.3 球菌

除乳酸菌外，球菌也是鱼露发酵过程主要的组胺产生菌来源之一。常见的组胺产生球菌有微球菌和葡萄球菌，目前关于微球菌产组胺的研究相对较少。陈踊南等[9]以冰冻保藏的新鲜金线鱼为原料腌制发酵鱼露，研究金线鱼发酵过程中组胺含量的变化规律，并对产组胺的关键细菌进行分离和鉴定。结果显示，组胺含量随金线鱼发酵时间的延长呈先升高后下降趋势，马胃葡萄球菌是金线鱼发酵过程中的主要产组胺菌。

3 鱼露生物胺检测方法

鱼露发酵过程中低浓度生物胺的产生可以提高鱼露风味，刺激食欲，但高浓度生物胺的摄入会使人产生潮红、头痛、恶心、皮疹、心悸、高低血压及呕吐等不良生理症状。鉴于生物胺对人体健康的潜在危害，开发快速、可靠、灵敏、常规的检测方法并对其含量进行控制对鱼露生产具有重要意义。分析鱼露中生物胺的检测方法有很多种，高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)是最常见的一种，此外，还包括气相色谱法(gas chromatography，GC)、薄层色谱法(thin layer chromatography，TLC)、生物传感器和毛细管电泳等等。由于鱼露基质非常复杂，需要采用适当提取和纯化方法对样品进行预处理。基于quechers(quick、easy、cheap、effective、rugged、safe)的净化技术以其“快速、简便、廉价、有效、耐用、安全”的优点被广泛应用于复杂鱼露样品的预处理[10]。

3.1 高效液相色谱法

HPLC法因其高选择性和敏感性而成为检测各类食品中生物胺最普遍的一种方法。由于鱼露发酵产生的生物胺分子缺少发色基团，因此在检测之前要先进行衍生化处理[11]。MOLAEI等[12]利用一种简化的高效液相紫外色谱法(high performance liquid chromatography-ultraviolet，HPLC-UV) 测定了17个商业鱼露样品和28个传统鱼露样品中生物胺的含量。所有样品结果显示，R2>0.993，加标回收率分别在97.16%～104.5%和97.2%～103.2%。PALOMINO-VASCO等[13]用邻苯二醛对样品进行衍生化，并使用超高效液相紫外色谱法测定了其中8种生物胺和9种前体氨基酸含量，15 min内实现了17个衍生物的分离，检测限(limit of detection，LOD)为7～210 μg/L，相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)为1.5%～6%。DUFLOS等[14]建立了用HPLC法定量测定鱼肌肉中组胺的方法，该方法经过7个欧洲国家的9个实验室验证，在3种食品(酶熟的鱼、无酶促熟的鱼和鱼露)中已经得到了应用。然而，由于柱前衍生高效液相色谱法测定生物胺的方法步骤繁琐、操作复杂，且常有副产物的干扰，对生物胺准确定量结果造成影响。近年来，很多研究者将HPLC法与其他技术联用提高了检测效率。ZARGHAMPOUR等[15]采用电膜萃取技术结合HPLC法检测食物中的微量生物胺，已成功地应用于鱼露样品中生物胺的测定。WANG等[16]首次采用超高效液相色谱-四极杆/飞行时间质谱联用技术，对鱼露发酵过程中的挥发性物质进行分离和测定，最终从鱼露样品中分离到了22 816个离子代谢产物，其中含有大量的生物胺。最近，EVANGELISTA等[17]提出了一种简便、高效的离子对高效液相色谱柱后衍生荧光检测法定量测定组胺的方法，已成功应用于淡水鱼、新鲜金枪鱼罐头内组胺的分析。

3.2 气相色谱法

GC法单独使用时不能得到直接的结果，需要与质谱、光谱等方法进行联用。PARCHAMI等[18]对顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术(head space solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-MIR-IMS)主要提取参数进行了优化，并提取和测定了鱼罐头样品中的生物胺含量，结果显示生物胺在50 μg/L水平下的相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)为5.7%～6.3%， 检测限(limit of detection，LOD)为0.6～1 ng/g，并已成功用于鱼露样品中生物胺的分析。YUAN等[19]用一种具有新型功能化涂层的萃取头对鱼露样品进行固相微萃取，并与GC-MS联用分析样品中的生物胺含量，RSD<6%，加标回收率为80.2%～101%，结果显示该方法简单、灵敏、精确度高。

3.3 薄层色谱法

TLC是一种线性度良好、重复性损失较小且快速便宜的检测方法。此外，该方法适用于多个样品的同时快速筛选。SHAKILA等[20]采用薄层色谱-密度法(thin layer chromatography-surface enhanced raman scattering，TLC-densitometric method)和HPLC法对鱼类生物胺的检测方法进行了分析比较研究。该方法成功用于检测鱼露中有毒组胺、腐胺和尸胺的含量。TAN等[21]用薄层色谱法与表面增强拉曼散射(thin layer chromatography-surface enhanced raman scattering，TLC-SERS)技术结合机器学习的分析方法，快速、灵敏、准确地检测金枪鱼样品中组胺含量，并从混合金枪鱼肉中分离出了组胺。

3.4 毛细管电泳法

毛细管电泳法(capillary electrophoresis，CE)的一个主要优点是可以注入小体积的样品，具有样品成本低、用量少、分离对象广、灵敏度高等特点。钱勇强[22]采用毛细管电泳-电化学发光(capillary electrophoresis-electrochemical luminescence，CE-ECL)法分析检测鱼露中的苯乙胺，RSD值为0.29%，加标回收率为102.19%～108.08%。HE等[23]探索了一种简单、快速的 CE方法，与常规紫外检测器联用，可分离13种食品中常见的生物胺。OEDIT等[24]使用三相微萃取(three-phase microextraction，3PEE)与CE的耦合技术成功提取了食品样品中5-羟色胺(5-HT)、酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)等生物胺，结果显示R2>0.996 7，RSD<14%，充分证明了3PEE在生物分析方面的潜力，已成功用于鱼露中生物胺的提取和分析。

3.5 生物传感器法

传统技术应用广泛的同时也有许多缺点，如需要昂贵精密仪器及样品处理繁复等。为解决传统方法应用的局限性，研究者近期开发了一种利用纳米材料传感器检测不同食品中组胺含量的研究，检测精度显著提高。CHOW[25]采用金纳米粒子(AuNPs)肉眼比色传感器来检测生肉、鱼、甲壳类动物中组胺的含量，从而判断它们的腐败情况，得到样品的LOD值为0.035～0.5 μg/mL。ALBANA等[26]用铼(Ⅳ)氧化物电极修饰非均相碳电化学法测定鱼酱油中的组胺含量，LOD为0.2～0.3 mg/L，RSD为5.7%～14%，该方法与分光光度法测定结果并无差异。ZHOU等[27]成功地制备了1种结合Fe3O4和Au@ATP@Ag纳米棒的高灵敏度三明治纳米传感器用于检测组胺含量，线性范围为10-3～10-8mol/L，R2= 0.990 7，可以快速、可靠地测定鱼样本中的组胺，为进一步开发超高灵敏度的组胺检测方法奠定了基础。

4 鱼露生物胺毒性

食品中高浓度的生物胺会导致不良的毒理学和感官效应。已经证明组胺和酪胺对人体血管和神经系统有直接或间接的影响。其他生物胺，如腐胺，虽然不构成直接风险，但会刺激组胺和酪胺的毒理学效应，对人体健康造成负面影响。组胺是鱼露中毒性最大的生物胺，口服8～40 mg、40～100 mg、100 mg以上的组胺依次会产生产生轻微、中等和严重的中毒症状。组胺中毒在全世界范围内时有发生。LEE等[28]针对台湾发生的食源性中毒事件收集了台湾零售商店炸鱼条和生鱼条样本并进行了调查，发现金枪鱼、鲭鱼、鲣鱼和鲱鱼中的组胺是造成人体中毒的主要原因。为此，各个国家和地区参考鱼露中生物胺含量情况，制定了在水产品和食品中的生物胺限量标准，如表1所示。

表1 水产品和食品中生物胺限量Table 1 Limits on biogenic amines in aquatic products and food

5 鱼露生物胺的控制

发酵过程中高含量生物胺的形成是影响鱼露品质的主要问题之一。通过缩短发酵周期可以控制生物胺的形成，但这又不利于开发独特风味的鱼露[29]。因此，可以考虑控制鱼露发酵过程的影响因素来控制生物胺的积累。影响因素包括发酵鱼的种类及前处理方式、温度、发酵剂、添加生物胺降解菌、植物或香料提取物、保鲜剂等。

5.1 发酵鱼的种类及前处理方式

鱼露发酵常用的原料鱼有金枪鱼、鲐鱼、鲣鱼、沙丁鱼、鲱鱼、风尾鱼、枪鱼、蓝鱼等。这些鱼的共同特点是都含有丰富的蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸，营养价值高。然而，不同种类的发酵鱼所含的蛋白质含量存在差异，酶解后形成了不同种类和含量的氨基酸，使得最终形成的组胺含量也有很大差异。其中金枪鱼、鲐鱼和鲣鱼的鱼体内游离组氨酸含量高达15 g/kg，沙丁鱼、鲱鱼、风尾鱼、枪鱼、蓝鱼中游离组胺酸含量为l g/kg左右，而新鲜海鱼中的组胺的含量低于10-3g/kg。除此之外，采用不同的致死方式对发酵鱼进行前处理，对生物胺的形成也有很大影响。周娇娇等[30]对活鳝鱼分别采用直接宰杀法、电击击晕宰杀法、冰水搅拌宰杀法、高温致死宰杀法4种致死处理方式，结果显示，不同处理方式后的鳝鱼中生物胺的含量也不同，其中电击击晕宰杀法处理后的鳝鱼中生物胺含量最低为8.04 μg/g，是一种良好的发酵鱼前处理方法。由此可见，合理选择鱼种和前处理方式是控制鱼露发酵过程生物胺积累的基础。

5.2 温度的控制

鱼露发酵过程温度、NaCl浓度、pH值、供氧量及添加剂等都对生物胺的形成有影响，其中温度是最重要的影响因素。鱼露发酵时的生物胺产生菌主要是乳酸菌、肠杆菌和球菌等，这些菌种的最适生长温度一般都在30～37 ℃，20 ℃以下几乎不生长。但鱼露中风味物质主要是由鱼体中的蛋白质、脂肪等大分子物质在微生物或内源性蛋白酶和脂肪酶的作用下分解转化而来，过度低温在降低游离氨基酸脱羧酶的活性的同时会减缓风味物质的形成。因此，合适的发酵温度可在保持鱼露风味的基础上抑制产胺菌的产生，是控制生物胺形成的有效途径。MERCOGLIANO等[31]研究了金枪鱼发酵过程组胺产生菌的主要影响因素，在金枪鱼供应链的视角下，考虑了鱼捕获和捕获后的条件，发现温度是预防金枪鱼供应链中组胺产生的最重要的控制措施。蒋倩倩[32]研究了不同贮藏温度下鲐鱼组胺含量的变化情况，发现冰冻保藏时的组胺增加速度最慢，但随着温度的升高，组胺增加的速度加快。郭慧[33]控制小黄鱼和带鱼的贮藏温度为0 ℃和25 ℃，以其中生物胺(尸胺、腐胺和酪胺)的含量变化情况作为评价海鱼鲜度的标准。研究结果表明，这2种鱼在0 ℃的保质期比在25 ℃的保质期延长了7～9 d。这说明低温抑制了海鱼中生物胺的积累，延长了贮藏期，提高了鲜度。

5.3 发酵剂的选择

鱼露发酵过程的发酵剂大部分来源于鱼体本身所携带的微生物，这些微生物具有较强的氨基酸脱羧酶活性，促使鱼露中的游离氨基酸发生脱羧反应形成生物胺。因此，选择本身没有氨基酸脱羧酶活性或具有胺氧化酶活性的菌株作为发酵剂是控制生物胺形成的关键步骤。KIM等[34]从1种鳀鱼酱中分离到1株无生物胺产生能力的嗜盐四联球菌(MJ4)，且未发现产生物胺的基因组。将此菌株作为发酵剂添加到咸鱼发酵过程中，代谢产物分析结果表明，菌株MJ4表达明显在发酵过程中抑制了生物胺的形成。可见，选用无氨基酸脱羧酶活性发酵剂是控制生物胺产生的有效方法。SINGRACHA等[35]研究了使用发酵剂 (TetragenococcushalophilusTS71，ZygosaccharomycesrouxiiA22和Meyerozyma(Pichia)guilliermondiiEM1Y52) 减少盐酱醪发酵和酱醪与发酵剂联合发酵后的生物胺和挥发性物质变化情况。发酵剂采用TS71/A22(L2)和TS71/A22/EM1Y52(L3)2种组合，结果表明，接种L2和L3的样品在发酵过程中生物胺的积累量较低。ZAMAN等[36]用具有胺氧化酶活性的发酵剂在35 ℃条件下发酵鱼露，发酵剂采用肉葡萄球菌FS19和淀粉寡乳杆菌FS05，并以不添加发酵剂作为对照组。发酵120 d后，FS19和FS05样品组的组胺浓度分别降低了27.7%和15.4%，总体生物胺浓度降低了15.9%和12.5%。这些研究结果表明，使用具有胺氧化酶活性的发酵剂发酵鱼露也能有效地控制生物胺的含量。

5.4 添加生物胺降解菌

通过添加某些微生物使其产生的酶类将生物胺降解，并转化为其他产物，是目前食品行业降低生物胺含量最有前景的一种方法。LEE等[37]在咸鱼发酵液中添加了1株具有胺类降解活性的多黏菌芽孢杆菌D05-1，使样品组的组胺、腐胺、尸胺和酪胺总含量与对照组相比减少了32.0%。姜维[38]从发酵鱼露样品中筛选8株生物胺降解菌株SWA25，并将其中1株添加到黄鲫鱼露的发酵生产过程中。与不添加菌株的空白对照组相比，添加生物胺降解菌株的鱼露发酵液中总生物胺含量降低了55.3%，其中的组胺、酪胺、尸胺、色胺、苯乙胺、腐胺分别降低了64.5%、59.2%、71.0%、63.4%、68.2%、22.0%，且发酵鱼露的感官风味没有影响，表明该菌株可作为生物胺降解菌有效用于黄鲫鱼露的安全生产。

5.5 添加植物提取物或保鲜剂

近年来，由于植物提取物对食品安全和营养特性有很大的好处，常作为抑菌剂广泛应用于食品和饮料行业，受到人们的强烈关注。KULEY等[39]使用乳杆菌(FI8595)或小球菌(acidolactici)结合百里香和月桂提取物(0.5%)加入到真空包装沙丁鱼鱼片里冷藏(3±1)℃ 8周。研究结果表明，百里香提取物和月桂提取物(0.5%)的使用能有效降低沙丁鱼中生物胺含量，是提高冷藏发酵沙丁鱼货架期的有效途径。KULEY等[40]在鲭鱼发酵液中加入红花和苦瓜提取物抑制了鲭鱼腐败细菌和食源性致病菌的生长，从而控制鲭鱼生物胺的形成。JIA等[41]研究表明了香料提取物对生物胺的积累有显著的抑制作用，其中桂皮、茴香提取物的抑制效果最好，并将此方法成功地应用到了控制鱼露中生物胺的积累。闵娟等[42]在马鲛鱼中加入不同浓度的大蒜提取物、生姜提取物、迷迭香提取物和龙须菜寡糖，有效降低了马鲛鱼中生物胺含量，延长了货架期。此外，在鱼露发酵过程添加复合保鲜剂也是控制生物胺积累的良好策略。蔡慧农等[43]用3种复合保鲜剂(A组：0.1%苯甲酸钠+食盐+变性淀粉；B组：含0.1%山梨酸钾+食盐+变性淀粉；C组：0.05%苯甲酸钠+ 0.05%山梨酸钾+食盐+变性淀粉)处理罗非鱼，结果表明，样品组中组胺和三甲胺含量均有下降，且样品C组中组胺和三甲胺含量最低，保鲜效果最好。管爱艳等[44]在新鲜的海鲈鱼中加入竹叶抗氧化物、茶多酚和乳酸链球菌素作为复合保鲜剂，降低了海鲈鱼中生物胺的含量，对海鲈鱼肉有较好的保鲜效果。

6 结论与展望

鱼露发酵过程产生的高浓度生物胺降低了鱼露的新鲜度，对鱼露的品质造成了极大影响。本文对鱼露生物胺产生菌和形成机理进行了分析和总结，探讨生物胺的检测技术，提出了生物胺的优化检测方法，尤以高效液相色谱法最为常用。鉴于高浓度生物胺具有毒性，多个国家和地区已制定生物胺在水产品和食品中的限量标准，但生物胺在鱼露中的限量标准还未曾报道，需进一步研究。目前，控制生物胺的技术已有一定程度的发展，但仅靠简单控制单一影响因素远远不够，可采用控制多个影响因素相结合的方法实现控胺。研发新型安全发酵剂，结合食品保鲜技术如低温保鲜、超高压保鲜技术、辐射保鲜及栅栏技术等，可有效提高生物胺控制效果，成为重要发展方向之一。筛选获得产谷氨酰胺转氨酶的微生物，控制氨基酸的转化途径从而降低生物胺，进而改善鱼露风味，符合生物胺控制技术的未来发展趋势，对鱼露调味品品质和市场开发具有重大意义。