银杏提取物中银杏酚酸类物质的毒性和药理活性研究进展*

李 颜，郭 澄

（上海市第六人民医院药剂科，上海 200233）

银杏Ginkgo biloba L. 属裸子植物银杏门唯一现存物种，被誉为植物界的“活化石”，原产于我国，现广泛种植于全世界。银杏始载于《神农本草经》，但对银杏（白果）、银杏叶药用价值的记载始于宋代。元代医家李杲在《食物本草》中最早记载了银杏的毒性和解毒方法，“小儿食之，发惊，多食，立死”“连饮冷白酒几盏，吐出则生”。后世历代医家多认为银杏有毒或小毒[1]。现代的植物化学研究已从银杏叶中发现160 多种化合物，主要为银杏黄酮类、银杏内酯类和银杏酚酸（GA）类成分[2－3]。近年来的研究显示，银杏叶中药制剂对冠心病、心绞痛、大脑退行性病变及心血管疾病引起的脑功能障碍、老年痴呆等疗效确切，银杏黄酮类和银杏内酯类是其临床疗效的物质基础。其中，GA 类成分一直被认为是引起临床不良反应的主要物质，有致敏性和致突变毒性，故GA 类的限量是评价银杏叶制剂质量的指标之一，但同时GA 类成分也具有抗菌、抗炎、抗肿瘤等生物活性[4]。现就近年来对GA 的研究进行综述，为其全面、合理地开发和利用提供参考，也提醒审慎思考银杏制剂临床使用中出现不良事件的原因。

1 毒性

1.1 致敏、致突变毒性

1998 年，HAUSEN[5]研究了银杏酸类对豚鼠的过敏反应，结果表明，纯酚酸物质可引起过敏，但银杏叶提取物未引起豚鼠过敏。BERG 等[6]对雄性中国仓鼠肺成纤维细胞的黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）的分析结果显示，3 个主要的GA（13 ∶0，15 ∶1，17 ∶1）无诱变的致突变性效力。

1.2 肝毒性

LIU 等[7]通过大鼠原代肝细胞和HepG2 细胞系模型研究Ⅰ相代谢酶对GA（15 ∶1）毒性的影响，结果发现GA（15 ∶1）对被CYP1A 和CYP3A 代谢后的代谢产物具有更强的细胞毒性。JIANG 等[8]以代谢组学方法结合生化测定研究，结果表明，GA（15 ∶1）可影响模型小鼠肝脏的氧化应激和嘌呤代谢水平，且具有剂量依赖性。YAO 等[9]的研究结果显示，参与GA（17 ∶1）的药物代谢酶为CYP1A2，CYP3A4，UGT1A6，UGT1A9，UGT2B15；从MMT 实验结果看，GA（17 ∶1）对HepG2 细胞的毒性作用呈时间和浓度依赖性，但对原代肝细胞的毒性低于HepG2 细胞，同时也表明CYP1A－和CYP3A 介导的代谢增加了GA（17 ∶1）的毒性。

1.3 其他

德国学者分别在2001 年和2002 年研究了银杏提取物的神经毒性作用，结果显示，GA 浓度依赖性地诱导鸡胚胎体外培养的神经细胞死亡，表现为染色质浓缩、核缩和蛋白质合成抑制剂放线菌酮损失减少，提示细胞死亡，可能的原因是激活蛋白磷酸酶type－2C[10－11]。HECKER 等[12]研究了GA 对人角质形成细胞系HaCaT和恒河猴肾小管上皮细胞系LLC－MK2 的影响，结果显示，GA 可能抑制溶酶体酶的形成，诱导乳酸脱氢酶的释放，从而引起HaCaT 细胞凋亡。BERG 等[6]采用雄性中国仓鼠肺成纤维细胞（V79）评价3 个主要GA 成分（13 ∶0，15 ∶1，17 ∶1）的细胞毒性，结果显示，24 h 内在高于50 mmol／L 浓度条件下孵化时，细胞毒性与浓度呈依赖关系。YAO 等[13]研究了GA（15 ∶1）对MDCK 细胞的致坏死作用及可能的机制，发现GA（15 ∶1）诱导细胞周期停滞在G0／G1和G2／M 期，影响DNA 合成和细胞有丝分裂，最终诱发肾毒性。RYCKEWAERT 等[14]通过体外实验和计算方法对GA 的毒性机制进行研究，结果显示，GA 能调节SIRT 活性，其特异性抑制谱和细胞毒与非特异性抑制剂（SIRT1 和SIRT2）相当，且不同于SIRT1 特异性抑制剂EX－527，非特异性SIRT 抑制被认为是其体外细胞毒性的新机制。

2 药理活性

2.1 抗肿瘤

不同学者对GA 在抑制肿瘤方面进行了体外研究，包括肺癌、结肠癌、肝癌、胃癌和肾癌。研究结果发现，GA 可通过调节不同的信号通路影响肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移。

上皮间质转化（EMT）是肿瘤细胞转移的关键环节。BAEK 等[15]研究发现，GA（15 ∶1）可抑制A549 和H1299肺癌细胞的增殖、侵袭和迁移。其抑制了EMT 相关基因[牵连蛋白、波形蛋白、N－钙黏蛋白(N－cadherin)，基质金属蛋白酶(MMP)－9，MMP－2，Twist，Snail]的表达，并抑制了转化生长因子－β(TGF－β)诱导的EMT，但不影响A549 和H1299 细胞中各种上皮标记蛋白（Occludin 和E－cadherin）的表达。这些研究表明，GA（15 ∶1）通过抑制PI3K／Akt／mTOR 信号通路来抑制肺癌的侵袭和迁移，并为控制肿瘤细胞的转移、扩散提供潜在的治疗性化合物来源。信号转导和转录激活因子3（STAT3）是致癌转录因子，可调节涉及多种血液恶性肿瘤包括多发性骨髓的进展。BAEK 等[16]的研究显示，GA（17 ∶1）表现出减弱STAT3 激活的作用，表明其在癌症中有潜在的治疗作用。QIAO 等[17]的研究结果表明，GA可减少SW480 结肠癌细胞增殖，并抑制迁移，且呈浓度依赖性。进一步研究发现，GA 通过诱导腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)激活和抑制侵袭相关蛋白的表达来实现。LIU 等[18]研究发现，GA 对结肠癌细胞的增殖、迁徙和入侵有抑制作用，GA 可引起肿瘤细胞G0／G1期阻滞并引发内源性细胞凋亡和ROS 调节的自噬，认为GA 可作为治疗结肠癌的潜在药物。LI 等[19]的研究结果显示，GA可抑制侵袭相关分子（MMP－2 和MMP－9）的表达，同时抑制HepG2 细胞EMT，进一步深入研究发现，其作用机制为下调HGF／c－Met 信号通路。LORENTE 等[20]的研究结果显示，GA 作为一种SUMO 蛋白修饰抑制剂，通过增加TRIB3 的表达和减少SUMO1 复合物的形成诱导自噬介导的肿瘤细胞死亡，从而达到抑制肿瘤细胞的作用。LIANG 等[21]研究发现，GA 可通过诱导细胞凋亡和抑制活性氧簇(ROS)调控的STAT3／JAK2 信号转导抑制胃癌细胞的生长。ZHU 等[22]研究发现，在体内外GA均 可 通 过 影 响 肾 细 胞 癌(RCC) 细 胞（786－O 和A498）G1期阻滞其活性和增殖。GA 还可减少RCC 细胞的侵袭和迁移。表皮生长因子受体（EGFR）是GA 的重要靶蛋白，GA 可显著抑制肾癌的EGFR 的信号传导，从而发挥其抗肾癌的作用。

2.2 抗炎杀菌

肠出血性大肠杆菌（EHEC）感染是世界性难题，目前尚无有效治疗方法。生物膜的形成与EHEC 感染密切相关，也是抗药性的机制。LEE 等[23]研究发现，5 μg／mL 的GA（15 ∶1，17 ∶1）及100 μg／mL 的银杏叶提取物在聚苯乙烯和玻璃表面，以及尼龙膜上均能抑制EHEC 生物膜的形成；转录分析结果表明，GA（15 ∶1）抑制了EHEC中的curli 基因和prohage 基因表达；此外，还发现GA和银杏叶提取物可抑制3 种金黄色葡萄球菌菌株生物膜的形成。该研究结果表明，植物次生代谢产物GA 是生物膜抑制剂的重要资源。HUA 等[24]使用绿色荧光蛋白（GFP）标记的细胞株研究了GA（15 ∶1）的抗菌活性及其潜在作用机制，推测GA（15 ∶1）是通过抑制解淀粉芽孢杆菌的蛋白质活性达到抗菌作用；同时发现，革兰阴性细菌细胞壁中某些成分可拦截GA（15 ∶1）大量渗透，这也是其对革兰阴性菌无明显抗菌作用的主要原因之一。LI 等[25]研究了GA 对氧化低密度脂蛋白（ox－LDL）引起的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)氧化的缓和作用，并明确了其分子机制，结果表明，GA 的抗炎特征是通过抑制NF－κB 通路减低诱导型一氧化氮(iNOS)和环氧合酶2(COX－2)并激发细胞因子实现的。GERSTMEIER 等[26]研究了GA 对脂质介质（LMs）生物合成的影响，结果发现，GA 在基于mPGES 的药效虚拟筛选和细菌刺激人M1 和M2 样巨噬细胞的实验中表现为促炎性LMs 生物合成酶的有效多靶点抑制剂，该结果有助于解释GA 复杂的药理作用和毒理学特征。ZHANG 等[27]研究了GA 抗ox－LDL 诱导的人微血管内皮细胞（HMEC－1）和人外周单个核细胞（nPBMCs）的氧化和炎性反应，结果表明，GA 可提高ox－LDL 处理后的细胞活性，且显著降低细胞内的ROS 和促炎性细胞因子，进一步发现GA 通过NF－κB 途径发挥抗炎作用。

2.3 神经保护

银杏叶标准提取物EGb761 被用于治疗阿尔茨海默病所致记忆力下降、精神分裂症、痴呆症等神经和精神方面的疾病。GA 对记忆力的影响目前仍未知。MANGO 等[28]通过电生理分析了GA 对海马长时程增强和突触传递的影响，发现GA 对Aβ 引起的神经递质损伤释放和突触可塑性具有神经保护作用。α－突触核蛋白（αsyn）集聚而成的胞浆内涵体（Lewy bodies）的积聚是帕金森病的主要病理特征，也能引起多巴胺能神经元变性。VIJAYAKUMARAN 等[29]在SH－SY5Y 神经母细胞瘤细胞和大鼠原代皮层神经细胞上观察了GA 对α－syn聚集体清除率的影响，结果显示，GA 能促进α－syn 聚集体的自噬性清除，提示可能在疾病治疗中具有潜在作用。

2.4 抗寄生虫

隐孢子虫是一种原生动物寄生虫，能引起免疫缺陷性腹泻和免疫功能低下性危及生命的腹泻。WU 等[30]通过体外细胞研究发现，GA 类物质对人腺癌（HCT－8）细胞株中隐孢子虫活性有一定的抑制作用，5.0 μg／mL 的GA 作用48 h 后培养基中隐孢子虫的数量明显减少，提示GA 可作为治疗隐孢子虫疾病的潜在候选药物。CHIDIEBERE 等[31]研究了GA（15 ∶1）在HCT－8 细胞株中抗隐孢子虫的活性，以NTZ（Nitazoxanide）作阳性对照药物，研究发现，GA 单体碳链的长度是影响抗隐孢子虫活性的重要因素，推测较长的烷基链有更高的膜渗透性，从而使药物运输更有效。

2.5 治疗糖尿病

YOON 等[32]利用C2C12 肌肉细胞和3T3－L1 前脂肪细胞筛选了658 种天然化合物对破坏胰岛素信号通路的蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）的影响，结果显示，GA 作为PTPN9 和DUSP9 的双重靶向抑制剂，可通过激活AMPK 信号传导增加3T2L1 和C2C12 细胞的葡萄糖摄取，提示GA 可作为治疗2 型糖尿病的候选药物。

2.6 抗氧化

泛素化作用于老化／氧化应激中下游环节。CHHUNCHHA等[33]研究发现，GA 可全面抑制晶状体上皮细胞中的异常类泛素化而减轻氧化应激，并明确了其作用机制是通过改变Sp1／Prdx6 的失调来实现的。

2.7 其他

甘氨酸受体（GlyRs）属五聚体环受体操作通道的超家族，参与许多生理功能，包括运动、视觉和疼痛。MALEEVA 等[34]通过CHO－K1 和N2a 细胞研究了银杏酚酸对甘氨酸受体的作用，结果显示，GA 是α1GlyRs的新型选择性增强剂[34]。LIU 等[35]研究发现，作为泛素化的抑制剂，GA 在间充质干细胞分化（MSCs）中有一定活性，在经过GA 预处理的小鼠骨髓基质细胞分化中能增强成脂前基因的表达，且在成脂培养基中培养后分化为脂肪细胞的效率更高；但在脂肪细胞形成后期添加GA 时，脂肪细胞的成熟明显受到抑制，同时多个脂肪生成基因的表达显著下调，提示了GA 在细胞治疗方面的潜能。BORENSTEIN 等[36]研究了GA 在体外通过抑制融合蛋白和病毒蛋白抑制单纯疱疹病毒1 型（HSV－1）的合成，显示出对GA 非包膜腺病毒也有抑制作用；同时，在感染后给予GA 同样可抑制HSV－1 和CMV 的复制，表明GA 具有靶向蛋白质和DNA 合成的二级机制。鉴于GA 对病毒感染的有效作用，即使在感染开始后，也可用于急性感染（如感染新型冠状病毒、埃博拉病毒、寨卡病毒、甲型流感病毒、麻疹病毒）和用于一些病毒的积极治疗（如HSV－1、HSV－2、水痘带状疱疹病毒）。

3 思考

银杏制剂临床使用的安全性是药学工作者关注的重点。GA 具有致敏性和致突变毒性，GA 的限量也是评价银杏制剂质量的关键指标之一。1997 年，德国卫生部规定银杏叶制剂中GA 含量应低于5 μg／g；《中国药典》自2010 年版起规定银杏叶提取物中总酚酸不得超过10 μg／g。GA 是一组混合物，包括5 种成分，即银杏新酸（13 ∶0）、银杏酸（15 ∶1）、十七烷二烯银杏酸（17 ∶2）、氢化银杏酸（15 ∶0）和十七烷二烯银杏酸（17 ∶1）。其中，银杏新酸（13 ∶0）、银杏酸（15 ∶1）和十七烷二烯银杏酸（17 ∶1）占总酚酸的90%[3]。但对GA 的毒性研究仍集中在体外的细胞毒性研究，对制剂中GA 引起人体的毒性损伤尚未见报道。银杏制剂临床需长期服用，GA 的体内代谢情况及是否有蓄积性毒性的研究报道也缺乏。此外，对GA 药理活性研究是目前研究的热点，特别是其抗肿瘤作用的研究。研究结果提示，GA 可作为潜在的抗肿瘤药物，同样是体外细胞药理学的研究结果，全面、合理地开发和利用GA 类制剂需做进一步的体内和临床研究。

GA 的研究文献分析，结合回顾性的临床试验分析[37]提示，对银杏提取物制剂致临床不良事件原因的思考除制剂所含成分外，还需考虑患者联合用药时发生的药物相互作用。银杏内酯A 和B 能促进肝代谢酶CYP3A4转录和蛋白表达，并增加其对底物的代谢能力，黄酮类成分（槲皮素和山柰酚）可抑制CYP3A4 活性，尤其是抑制体内硝苯地平的代谢，且随着黄酮摄入的增加，其程度进一步加强，导致不良反应（头痛、头晕、心率加快、虹膜出血）的发生[38]。也有学者发现，银杏对CYP2C19 有明显的诱导作用，可提高奥美拉唑代谢物的血药浓度，但未见其引发不良事件的报道[39]。由于银杏类制剂并非CYP 家族的强诱导或强抑制类制剂，根据已有文献和临床观察，对硝苯地平等药物合用引发的不良反应需重点关注[38]。